توصيل الخلايا الليمفاوية التائية المستجيبة إلى الفئران التي تحمل أورام الدماغ البشرية

الملخص

المصدر: Jarry، U.، et al. النقل التجسيمي بالتبني للخلايا المناعية السامة للخلايا في نماذج الفئران للورم الأرومي الدبقي البشري متعدد الأشكال الطعوم الغريبة. J. Vis. Exp. (2018).

يوضح هذا الفيديو تقنية حقن تجسيمية لإدارة الخلايا الليمفاوية التائية المستجيبة البشرية في نموذج الفئران الذي يحمل ورما في الدماغ البشري. عند وضع فأر مخدر يحمل الورم على إطار تجسيمي وإنشاء ثقب لدغ في موقع الحقن على الجمجمة ، يتم حقن الخلايا الليمفاوية التائية المستجيبة في موقع الورم.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد. تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

فئة

1. التوسع غير المحدد للخلايا الليمفاوية التائية السامة للخلايا

1. تحضير وإشعاع الخلايا المغذية عند 35 جراي. لتحفيز 2 × 10⁵ - 4 × 10⁵ خلايا مستجيبة ، قم بإعداد 10 × 10⁶ خلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMCs) و 1 × 10⁶ خطوط خلايا أرومية ليمفاوية بائية (BLCLs) من ثلاثة متبرعين متمايزين وأصحاء.
2. أعد تعليق كل من الخلايا المغذية والخلايا المستجيبة في 15 مل من متوسط معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) مكمل بمصل ربلة الساق الجنينية المعطلة بالحرارة بنسبة 10٪ ، و 2 ملي لتر جلوتامين ، والبنسلين (100 وحدة دولية / مل) ، والستربتومايسين (0.1 ميكروغرام / مل) و 300 وحدة دولية / مل المؤتلف إنترلوكين -2 (IL-2).
3. أضف هيماجلوتينين نباتي (PHA-L) بتركيز نهائي قدره 1 ميكروغرام / مل ، واخلطه بعناية ، ووزع 150 ميكرولتر من تعليق الخلية لكل بئر في ألواح ذات قاع U 96 بئر.
4. احتضان عند 37 درجة مئوية وبنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ في جو رطب.
5. افحص اللوحة يوميا حتى تتشكل كتل خلايا كبيرة في آبار الثقافة (~ اليوم 7).
6. انقل الخلايا إلى قارورة مزرعة بمعدل 1 × 10⁶ خلايا / مل في وسط مزرعة طازجة.
7. حدد العدد الإجمالي للخلايا عن طريق العد (2x في الأسبوع) واحتفظ بها عند 1 × 10⁶ خلايا / مل في وسط زراعة طازجة.
   ملاحظه: يجب أن تكون الخلايا المناعية المستجيبة جاهزة للإعطاء العلاجي في حالة الراحة (عادة بعد 3 أسابيع من تحفيز التضخيم الأولي). يجب التحقق من نقاء وتفاعل هذه الخلايا المستجيبة قبل الحقن في الجسم الحي (على سبيل المثال ، مع فحوصات في المختبر).

< p class = "jove_title" >2. تحضير الخلايا المستجيبة قبل الجراحة

1. بعد التحقق من عدد خلايا المستجيب ، اجمع الخلايا المستجيب في أنبوب سعة 50 مل عن طريق الطرد المركزي (300 × جم لمدة 5 دقائق).
   ملاحظه: للتعويض عن أي خسارة ، قم بإعداد فائض من الخلايا (على سبيل المثال ، 50 × 10⁶).
2. قم بإزالة المادة الطافية بعناية وأعد تعليق الخلايا في 15 مل من PBS المعقم وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 300 × جم لإجراء الغسيل.
3. قم بإزالة المادة الطافية بعناية وبشكل كامل ثم أعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من PBS المعقم.
4. انقل الخلايا المعلقة في أنبوب دقيق سعة 1.5 مل للطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
5. قم بإزالة المادة الطافية بعناية وبشكل كامل عن طريق سحب العينة ببطء.
6. أعد تعليق حبيبات الخلية في 8 ميكرولتر من PBS المعقم لكل ماوس.
   ملاحظه: هذه خطوة حاسمة.
7. قم بقياس حجم تعليق الخلية باستخدام ماصة دقيقة. إذا لزم الأمر ، أضف PBS معقم (20 × 10⁶ خلايا في 15 ميكرولتر من PBS لكل جرعة) واخلطها بعناية.
8. تحقق باستخدام ماصة دقيقة من أن الحجم النهائي لكل فأرة يتراوح بين 15 و20 ميكرولتر (< 20 ميكرولتر حتميا).
9. احتفظ بالخلايا على الجليد حتى الحقن التجسيمي.
   ملاحظه: لم يتم اختبار أكثر من 3 ساعات من الوقت.

< p class = "jove_title" >3. الحقن التجسيمي

1. إعداد المعدات
   1. قم بتجميع ومعايرة إطار تجسيمي للحيوانات الصغيرة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لضمان دقة الحقن داخل الجمجمة (على سبيل المثال ، حجم المحقنة والحجم المطلوب ومعدل الحقن).
      ملاحظه: يوصى بمعدل تسريب بطيء (أي 2-3 ميكرولتر / دقيقة).
   2. قم بتثبيت المادة تحت خزانة أمان ميكروبية (MSC) للحفاظ على عقم الأدوات وحماية الفئران من العدوى.
      ملاحظه: ضع "كتل متساوية الحرارة" في حمام مائي عند 37 درجة مئوية. يحد هذا النظام من انخفاض حرارة الفئران أثناء الجراحة. يجب استخدام وسادات التدفئة ، الضرورية للرعاية اللاحقة للإجراءات ، أثناء المراقبة المستمرة لدرجة الحرارة.
2. تحضير قبل الجراحة
   1. تخدير الفأر بحقن داخل الصفاق من الكيتامين (10 ملغم/مل) والزيلازين (0.1 ملغم/مل) عند 10 ميكرولتر/غرام من وزن جسم الفأر.
   2. قم بإجراء اختبار قرصة إصبع القدم للتأكد من التخدير الكامل والتسكين للحيوان.
      ملاحظه: أي حركة هي مؤشر على التسكين غير العميق ، وإذا حدث ذلك ، فستكون هناك حاجة إلى بضع دقائق أخرى قبل تكرار العملية.
   3. بمجرد تخدير الفأر بشكل صحيح ، استخدم المقص لإزالة الفراء من موقع الجراحة (بين الأذنين ، حتى الأنف).
3. تحضير الخلية قبل الجراحة
   أعد
   1. تعليق الخلايا بعناية باستخدام ماصة (عدة مرات) قبل كل حقنة لمنع أي تكتل للخلايا.
   2. ارسم بعناية حجم تعليق الخلية المطلوب (15-20 ميكرولتر) في المحقنة الدقيقة 22-G لتجنب شفط الفقاعات.
      ملاحظه: تعد خطوة تحميل الخلايا هذه في المحقنة الدقيقة مهمة لتقليل التباينات في الأحجام المحقونة. أعد تحميل الخلايا لكل حقنة فردية بين الإجراءات لمنع أي تكتل للخلايا ولضمان عدد زوجي من إدارة الخلايا المستجيبة في المجموعة.
   3. ثم ضع المحقنة في مضخة الحقنة المعدلة.
4. الرعاية الإجرائية
   1. تطهير موقع الجراحة بمسحات مبللة بمحلول بوفيدون واليود 5٪ 3 مرات على الأقل.
   2. ضع مرهما مزيدا للعيون في عيون الفأر لمنع جفاف القرنيات.
   3. ضع الماوس المخدر على الإطار التجسيمي ، على كتلة دافئة متساوية الحرارة مغطاة بغلاف بلاستيكي معقم للحفاظ على درجة حرارة الماوس أثناء الجراحة والحد من معدل الوفيات.
      ملاحظه: يجب وضع أنف الفأر وأسنانه بشكل مناسب فوق قضيب الأسنان ، لضمان تدفق الجهاز التنفسي الكافي أثناء العملية.
   4. بمجرد وضع الماوس فوق قضيب الأسنان ، شد قضبان الأذن بإحكام تحت أذني الماوس لشل حركة الرأس.
      ملاحظه: احرص على عدم إتلاف طبلة الأذن أو الإضرار بالتنفس.
   5. قم بعمل شق جلدي سهمي بطول 1-2 سم بمقص معقم على طول الجزء العلوي من الجمجمة من الأمام إلى الخلفي لكشف الجمجمة.
   6. حدد تقاطع الغرز السهمية والإكليلية (Bregma) لتكون بمثابة معالم للتوطين التجسيمي قبل الحقن (كما هو موضح في الشكل 1).
   7. ضع المحقنة فوق هذه النقطة.
   8. حرك المحقنة الدقيقة 2 مم إلى اليمين الجانبي و 0.5 مم أمام Bregma.
   9. باستخدام مثقاب دقيق ، قم بعمل ثقب صغير في الجمجمة باستخدام مثقاب معقم بإحداثيات محددة مسبقا. احرص على البقاء سطحيا لتجنب أي إصابة مؤلمة في الدماغ.
      ملاحظه: في هذا البروتوكول ، تم حقن الخلايا المناعية داخل ورم ثابت (بعد أسبوع واحد من حقن الخلايا السرطانية). يجب إعادة فتح الجلد (ندبة) ويتم إجراء الحقن بنفس الإحداثيات المستخدمة لزرع الخلايا السرطانية (لا يزال الثقب موجودا بشكل عام حتى أسبوعين بعد الحقن). تم اختيار الإحداثيات لحقن الخلايا السرطانية والمستجيبة في حمة الدماغ.
5. حقن الخلايا المستجيبة المناعية
   1. أدخل المحقنة الدقيقة بعناية في الحفرة المحفورة ، وتحرك ببطء ، وقم بالأمام بمقدار 3 مم لأسفل في الجافية ثم للخلف 0.5 مم إلى العمق النهائي البالغ 2.5 مم قبل حقن الخلايا المستجيبة.
   2. قم بتشغيل حقن الخلية المستجيبة بسرعة 2-3 ميكرولتر / دقيقة وراقب الفئران طوال وقت الحقن.
   3. بمجرد اكتمال الحقن ، اسحب الإبرة لمدة 1 مم فقط واحتفظ بالمحقنة الدقيقة في مكانها لمدة دقيقة إضافية قبل سحب المحقنة الدقيقة ببطء ، لمنع أي تسرب من موقع التسريب.
      ملاحظه: بعد إزالة من الجهاز التجسيمي ، قم بتنظيف معدات الحقن على الفور للتجارب القادمة.
6. رعاية ما بعد الجراحة ومتابعة الفأر
   1. قم بإزالة من الإطار التجسيمي وقم بتطبيق محلول بوفيدون اليود 5٪ على الفور على موقع الشق وأغلق الجلد بخياطة جراحية مناسبة.
   2. يوضع جل ليدوكائين 2٪ مباشرة على الجرح ويعطى 0.15 ميكروغرام/غرام من البوبرينورفين عن طريق الحقن تحت الجلد لعلاج التسكين بعد الإجراءات.
   3. ضع الفأر المخدر مرة أخرى إلى قفصه فوق وسادة تسخين مضبوطة على 37 درجة مئوية للحفاظ على درجة حرارة مناسبة لجسم الماوس ولتجنب أي انخفاض في حرارة الجسم.
      ملاحظه: السكن المنفصل ليس ضروريا.
   4. راقب الماوس حتى يتعافى تماما من التخدير وانقله إلى غرفة سكنية.
      ملاحظه: حتى الآن ، هذا البروتوكول مدعوم جيدا حيث حدثت بعض المضاعفات غير المتوقعة (< 5٪ من الفئران المحقونة).
   5. راقب الفئران يوميا وقم بالقتل الرحيم عند ملاحظة أي علامات صحية متدهورة (على سبيل المثال ، الوضعية المنحنية ، أو انخفاض الحركة ، أو السجود ، أو فقدان وزن الجسم بشكل كبير [≥ 15٪]).

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: صورة للمعالم التشريحية الرئيسية على جمجمة الفأر. وهذا يشمل الغرز السهمية (الخط الأحمر) والإكليل (الخط الأزرق) وتقاطعها (Bregma) المستخدمة لتوجيه موقع الحقن. يشار إلى شريط المقياس.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات PBMCs من 3 متبرعين أصحاء مختلفين BLCLs من 3 مانحين مختلفين معهد روزويل بارك التذكاري المتوسط (RPMI) جيبكو 31870-025 FCS دوتشر S1810-500 ل-جلوتامين جيبكو 25030-024 البنسلين / الستربتومايسين جيبكو 15140-122 IL-2 نوفارتيس البرولوكين PHA-L سيغما L4144 إطار تجسيمي شركة ستويلتينج 51600 محول الماوس للإطار التجسيمي شركة ستويلتينج 51624 حاقن مضخة microsyringe WPI UMP3-4 حقنة NanoFil WPI NF34BV-2 فئران NSG نهر تشارلز NSGSSFE07S الكيتامين ميريال إمالجين 1000 زيلازين باير رومبور 2٪ مقص WPI 201758 ملقط WPI 501215 أومني دريل 115/230 فولت WPI 503598 فيكريل 4-0 إيثيكون VCP397H زيلوكائين أسترازينيكا 3634461