مقالة منهجية

التعديل الوراثي للخلايا التائية CAR باستخدام نظام CRISPR-Cas9

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Sterner ، R. M. et al. ، باستخدام CRISPR / Cas9 لضرب GM-CSF في خلايا CAR-T.J. Vis. Exp. (2019)

يحدد الفيديو عملية إنشاء خلايا CAR T المعدلة وراثيا من خلال نظام CRISPR-Cas9. يؤدي إصابة الخلايا التائية بفيروسات العدسات CRISPR و CAR إلى تعديلات على الجين المستهدف وتخليق مستقبلات مستضد خيميرية أو CAR ، مما يؤدي في النهاية إلى تكوين خلايا CAR T المعدلة وراثيا.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
فئة

1. إنتاج خلايا CART19

  1. عزل الخلايا التائية وتحفيزها وثقافة خارج الجسم الحي
    1. القيام بجميع أعمال زراعة الخلايا في غطاء زراعة الخلايا باستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة. حصاد خلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMCs) من مخاريط دم المتبرعين الطبيعية التي لم يتم التعرف عليها والتي تم جمعها أثناء الفصادة حيث من المعروف أنها مصدر قابل للتطبيق ل PBMCs.
    2. لعزل PBMCs ، أضف 15 مل من وسط تدرج الكثافة إلى أنبوب فصل تدرج الكثافة 50 مل. تمييع دم المتبرع بكمية متساوية من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) يحتوي على 2٪ مصل بقري جنيني (FBS) لتجنب محاصرة الخلايا.
      1. أضف دم المتبرع المخفف من المخروط إلى أنبوب الفصل ، مع الحرص على عدم إزعاج الواجهة بين الدم ووسط تدرج الكثافة. جهاز طرد مركزي عند 1,200 × جم لمدة 10 دقائق عند RT.
      2. صب المادة الطافية في شكل مخروطي جديد سعة 50 مل ، واغسلها باستخدام PBS + 2٪ FBS عن طريق إحضار ما يصل إلى 40 مل ، وجهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 8 دقائق في RT ، وشفط المادة الطافية ، وإعادة التعليق في 40 مل من المخزن المؤقت ، وعد الخلايا.
    3. عزل الخلايا التائية من PBMCs عبر مجموعة حبة مغناطيسية للاختيار السلبي باستخدام فاصل خلية مؤتمت بالكامل وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
    4. لزراعة الخلايا التائية المعزولة ، قم بإعداد وسط الخلايا التائية (TCM) الذي يتكون من 10٪ مصل AB البشري (v / v) ، و 1٪ بنسلين - ستربتومايسين - جلوتامين (v / v) ، ووسط الخلايا المكونة للدم الخالي من المصل. قم بتعقيم الوسط عن طريق الترشيح من خلال مرشح فراغ معقم 0.45 ميكرومتر ثم باستخدام مرشح فراغ معقم 0.22 ميكرومتر.
    5. في اليوم 0 (يوم تحفيز الخلايا التائية) ، اغسل حبات CD3 / CD28 قبل تحفيز الخلايا التائية. للغسيل ، ضع الحجم المطلوب من الخرز (استخدم ما يكفي من حبات CD3 / CD28 لنسبة 3: 1 خرزات: الخلايا التائية ؛ لاحظ أن تركيز الخرز يمكن أن يكون متغيرا) في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم سعة 1.5 مل وإعادة تعليقه في 1 مل من الطب الصيني التقليدي.
    6. ضعها على اتصال مع المغناطيس.
    7. بعد 1 دقيقة ، قم بشفط الطب الصيني التقليدي وقم بتعليقه في 1 مل من الطب الصيني التقليدي الطازج لغسل الخرز.
    8. كرر هذا الإجراء لما مجموعه ثلاث غسلات.
    9. بعد الغسيل الثالث ، قم بتعليق الخرزات في 1 مل من الطب الصيني الصيني.
    10. عد الخلايا التائية.
    11. نقل الخرزات إلى الخلايا التائية بنسبة 3: 1 الخرز: الخلايا.
    12. تمييع الخلايا إلى تركيز نهائي 1 × 106 خلايا / مل.
    13. احتضان عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 24 ساعة.
  2. تعداء الخلايا التائية ونقلها
    1. قم بتنفيذ أعمال العدسات باستخدام احتياطات BSL-2 + ، بما في ذلك أغطية زراعة الخلايا ، ومعدات الحماية الشخصية ، وتطهير المواد المستخدمة بالمبيض قبل التخلص منها.
    2. الحصول على مستقبلات مستضد خيمرية - T19 (CART19) في ناقل عدسي.
      ملاحظه: تم تصميم بنية CART19 المستخدمة هنا ثم تصنيعه من جديد باستخدام بائع تخليق البروتين المتاح تجاريا. تم استنساخ بنية CAR لاحقا في فيروس عدسي من الجيل الثالث تحت سيطرة محفز EF-1α. جزء المنطقة المتغيرة أحادية السلسلة مشتق من استنساخ FMC63 ويتعرف على CD19 البشري. يمتلك بناء CAR19 مجالا قابلا للتكلفة من الجيل الثاني 4-1BB وتحفيز CD3ζ (FMC63-41BBz).
    3. أداء إنتاج الفيروسات العدسية كما هو موضح سابقا.
      1. باختصار ، لإنتاج فيروس العدسات ، استخدم 293T-cells التي وصلت إلى 70-90٪ من التقاء.
      2. السماح بالحضانة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة من الكواشف النفقة بما في ذلك 15 ميكروغرام من البلازميد الفيروسي العدسي محل الاهتمام ، و 18 ميكروغرام من ناقل التعبئة والتغليف gag / pol / tat / rev ، و 7 ميكروغرام من ناقل مغلف VSV-G ، و 111 ميكرولتر من كاشف ما قبل التعقيد ، و 129 ميكرولتر من كاشف التعدي ، و 9.0 مل من وسط التعداء قبل إضافته إلى خلايا 293T. ثم استزراع الخلايا المنقولة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
      3. الحصاد ، جهاز الطرد المركزي (900 × جم لمدة 10 دقائق) ، مرشح (مرشح نايلون 0.45 ميكرومتر) ، ومركز طافي عند 24 و 48 ساعة عن طريق الطرد المركزي الفائق إما عند 13,028 × جم لمدة 18 ساعة أو 112,700 × جم لمدة ساعتين.
      4. تجميد عند -80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل.
    4. في اليوم الأول ، قم بتعليق الخلايا التائية برفق لتفتيت وريدات الخلايا التائية التي تم تحفيزها عند 1 × 106 / مل في اليوم 0.
    5. في ظل احتياطات BSL-2+ المناسبة لجميع أعمال الفيروسات العدسية، أضف الفيروسات المحصودة الطازجة أو المجمدة إلى الخلايا التائية المحفزة بتعدد العدوى (MOI) 3.0.
  3. توسيع الخلايا التائية CAR
    1. خلال مرحلة التمدد ، استمر في احتضان الخلايا التائية المنقولة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2. عد الخلايا التائية CAR في اليومين 3 و 5 ، وأضف TCM طازجا ودافئا مسبقا إلى المزرعة للحفاظ على تركيز الخلايا التائية CAR 1 × 106 / مل.
    2. قم بإزالة الخرزات من الخلايا التائية المنقولة بعد 6 أيام من التحفيز (اليوم 6) باستخدام مغناطيس. قم بحصاد الخلايا التائية وتعليقها ووضعها في أنابيب مخروطية سعة 50 مل في مغناطيس لمدة 1 دقيقة. ثم اجمع المادة الطافية (التي تحتوي على الخلايا التائية CAR) ، وتخلص من الخرز.
    3. ضع الخلايا التائية المستضدة المستضدة المستضدة المستضدة للمستقبلات المجمعة مرة أخرى في المزرعة بتركيز 1 × 106 خلايا / مل لاستئناف التمدد.
    4. في اليوم 6 ، قم بتقييم التعبير السطحي ل CAR عن طريق قياس التدفق الخلوي.
      ملاحظه: يمكن استخدام عدة طرق للكشف عن التعبير السطحي ل CAR ، مثل التلوين بجسم مضاد ثانوي ممتص IgG مضاد للفأر (H + L) أو عن طريق التلوين باستخدام ببتيد خاص ب CD19 ، مقترن بالفلوروكروم. هنا ، خذ كمية (حوالي 100,000 خلية تائية) من المزرعة واغسلها بمحلول التدفق المحضر باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco ، ومصل بقري جنين 2٪ ، و 1٪ أزيد الصوديوم. قم بتلطيخ الخلايا بالجسم المضاد ل CAR واغسله مرتين. تلطيخ الخلايا بصبغة حية / ميتة وجسم مضاد أحادي النسيلة CD3 (OKT3). اغسل الخلايا وأعد تعليقها في عازلة التدفق. احصل على مقياس الخلوي لتحديد كفاءة التحويل.
  4. الحفظ بالتبريد للخلايا التائية CAR
    1. لحصاد الخلايا التائية CAR وحفظها بالتبريد بعد 8 أيام من التحفيز (اليوم 8 من توسع الخلايا التائية) ، حصاد الخلايا من المزرعة.
    2. تدور لمدة 5 دقائق عند 300 × جم.
    3. يعاد تعليقه في وسط التجميد عند 10 ملايين خلية لكل مل لكل قارورة في وسط تجميد يتكون من 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد و 90٪ مصل بقري جنيني.
    4. قم بالتجميد في وعاء تجميد لتحقيق معدل تبريد -1 درجة مئوية / دقيقة في فريزر -80 درجة مئوية ثم انقله إلى النيتروجين السائل بعد 48 ساعة.
    5. قبل استخدامها في التجارب المختبرية أو في الجسم الحي ، قم بإذابة الخلايا التائية CAR في الطب الصيني التقليدي الدافئ.
    6. اغسل الخلايا لتخفيف وإزالة ثنائي ميثيل سلفوكسيد وإعادة تعليقها إلى تركيز 2 × 106 خلايا / مل في الطب الصيني التقليدي الدافئ. استرح طوال الليل عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
< p class = "jove_title" >2. عامل تحفيز مستعمرة البلاعم المحبب (GM-CSF k / o) إنتاج CART19

  1. لتعطيل GM-CSF ، استخدم دليل الحمض النووي الريبي (gRNA) الذي يستهدف exon 3 من GM-CSF البشري (CSF2) الذي تم اختياره عبر فحص gRNAs التي تم الإبلاغ عنها سابقا على أنها تتمتع بكفاءة عالية لجين CSF2 الذي يشفر للسيتوكين البشري GM-CSF.
    ملاحظه: تم استخدام بنية الفيروسات العدسية من الجيل الثالث Cas9 المصنوعة تجاريا من الدرجة البحثية التي تحتوي على هذا الحمض النووي الريبي (تحت محفز U6). يحتوي التركيب على جين مقاومة بورومايسين. تسلسل الحمض النووي الريبي هو GACCTGCCTACAGACCCGCC.
  2. لإنتاج فيروس العدسات ، استخدم خلايا 293T التي وصلت إلى 70-90٪ من التقاء.
  3. اسمح ب 15 ميكروغرام من البلازميد الفيروسي العدسي ذي الأهمية ، و 18 ميكروغرام من ناقل تغليف gag / pol / tat / rev ، و 7 ميكروغرام من ناقل مغلف VSV-G ، و 111 ميكرولتر من كاشف ما قبل المعقدة ، و 129 ميكرولتر من كاشف التعدي ، و 9.0 مل من وسط التعدي للاحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  4. أضف كواشف التعداء إلى خلايا 293T. الثقافة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون (CO2).
  5. الحصاد ، جهاز الطرد المركزي (900 × جم لمدة 10 دقائق) ، الفلتر (مرشح النايلون 0.45 ميكرومتر) ، والتركيز الطافي عند 24 و 48 ساعة عن طريق الطرد المركزي الفائق إما عند 13،028 × جم لمدة 18 ساعة أو 112،700 × جم لمدة ساعتين والتجميد عند -80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل.
  6. في اليوم 1 ، قم بتعليق الخلايا التائية برفق لتفتيت الوريدات.
  7. في مختبر معتمد من BSL-2+ ، أضف فيروسا مجمدا أو تم حصاده حديثا إلى الخلايا التائية المحفزة لتوليد الخلايا التائية CAR. قم بتحويل الخلايا التائية مع كل من فيروس العدسات CAR19 و GM-CSF الذي يستهدف فيروس العدسات CRISPR. أضف فيروس العدسات CAR19 في وزارة الداخلية 3. نظرا لأن معايرة فيروس العدسات CRISPR لم تكن ممكنة ، استخدم جزيئات الفيروس الناتجة عن مستحضر بلازميد 15 ميكروغرام لنقل خلايا 10 × 106 T
  8. انظر الخطوات المتبقية لتحفيز الخلايا التائية وتوسعها وحفظها بالتبريد كما تمت مناقشتها في الخطوة 1.
  9. بالنسبة للخلايا التائية المعدلة بواسطة lentiCRISPR والتي تحمل مقاومة البيورومايسين، عالج الخلايا التي تحتوي على بيرومايسين ثنائي هيدروكلوريد بتركيز 1 ميكروغرام من بورومايسين لكل 1 مل في اليوم 3 واليوم 5.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات CD3 الجسم المضاد أحادي النسيلة (OKT3) ، PE ، eBioscience إنفيتروجين 12-0037-42 CD3 الأجسام المضادة أحادية النسيلة (UCHT1) ، APC ، eBioscience إنفيتروجين 17-0038-42 تشويس طاق بلو ماسترميكس دينفيل العلمية C775Y51 CTS (أنظمة العلاج الخلوي) Dynabeads CD3 / CD28 جيبكو 40203 د نظام CytoFLEX B4-R2-V2 بيكمان كولتر ج 10343 مقياس التدفق الخلوي ثنائي ميثيل سلفوكسيد ميليبور سيجما D2650-100 مل محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco جيبكو 14190-144 Dynabeads MPC-S (مكثف الجسيمات المغناطيسية) الأنظمة الحيوية التطبيقية أ 13346 مغناطيس سهل 50 EasySep تقنيات STEMCELL 18002 طقم عزل الخلايا التائية البشرية EasySep تقنيات STEMCELL 17951 الخرز المغناطيسي للاختيار السلبي ؛ 17951RF يتضمن نصائح ومخزن مؤقت مصل الأبقار الجنينية ميليبور سيجما F8067 FITC ماوس مضاد للإنسان CD107a BD Pharmingen 555800 وسط التثبيت (متوسط أ) إنفيتروجين GAS001S100 GenCRISPR gRNA البناء: الاسم: CSF2 GenScript N / A ترتيب مخصص دليل كريسبر RNA 1 ؛ الأنواع: الإنسان ، الناقلات: pLentiCRISPR v2 ؛ المقاومة: أمبيسلين. رقم النسخة: عال; تحضير البلازميد: التسليم القياسي: 4 ميكروغرام (مجانا من التهمة) الماعز المضاد IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي الممتز ، Alexa Fluor 647 إنفيتروجين أ -21235 https://tide.nki.nl. علم الوراثة المكتبي مصل AB البشري. المتبرعون الذكور؛ اكتب AB لنا كورنينج 35-060-CI IFN جاما الجسم المضاد أحادي النسيلة (4S. B3) ، APC-eFluor 780 ، eBioscience إنفيتروجين 47-7319-42 كاشف الإرسال Lipofectamine 3000 إنفيتروجين L3000075 طقم بقع الخلايا الميتة الميتة LIVE / DEAD القابل للإصلاح ، لإثارة 405 نانومتر إنفيتروجين L34966 ليمفاوريب تقنيات STEMCELL 7851 محلول مونينسين ، 1000X بيو ليجند 420701 الفأر المضاد للبشر CD28 استنساخ CD28.2 BD Pharmingen 559770 استنساخ CD49d مضاد للبشر 9F10 BD Pharmingen 561892 الفأر المضاد للإنسان MIP-1β PE-Cy7 BD Pharmingen 560687 حاوية التجميد السيد فروستي الترمو: العلمية 5100-0001 NALM6 ، استنساخ G5 ATCC CRL-3273 خط خلايا ابيضاض الدم الليمفاوي الحاد ماء خال من النوكليز بروميجا ص 119 ج أنظمة فلتر الفراغ أوليمبوس ، 500 مل ، غشاء PES ، 0.22 ميكرومتر ، معقم جينيسي العلمية 25-227 أنظمة فلتر الفراغ أوليمبوس ، 500 مل ، غشاء PES ، 0.45 ميكرومتر ، معقم جينيسي العلمية 25-228 أوبتي-ميم I مصل متوسط (1X)، سائل جيبكو 31985-070 PE-CF594 ماوس مضاد للإنسان IL-2 BD هورايزون 562384 البنسلين والستربتومايسين والجلوتامين (100X) ، سائل جيبكو هاتف: 10378-016 وسط النفاذية (متوسط ب) إنفيتروجين GAS002S100 مجموعة PureLink الجينومية للحمض النووي المصغرة إنفيتروجين K182001 بوروميسين ثنائي هيدروكلوريد MP Biomedicals، Inc. 210055210 طقم استخراج جل QIAquick كياجين هاتف: 28704 الفئران المضادة للإنسان GM-CSF BV421 BD هورايزون 562930 روبوسيب-إس تقنيات STEMCELL 21000 فاصل الخلايا الآلي بالكامل SepMate-50 (IVD) تقنيات STEMCELL 85450 أزيد الصوديوم ، 5٪ (وزن / حجم) ريكا كيماويات 7144.8-16 X-VIVO 15 خلية مكونة للدم خالية من المصل متوسطة لونزا 04-418س

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CRISPR Cas9 SystemCAR T CellsLentivirus TransductionGene KnockoutPuromycin SelectionT Cell ModificationChimeric Antigen ReceptorGranulocyte Macrophage Colony Stimulating FactorUltracentrifugationAntibiotic Resistance

مقالات ذات صلة