تقنية CRISPR-Cas9 لتحرير الجينات في الخلايا التائية

الملخص

المصدر: Agarwal، S.، et al. إنتاج خلايا CAR-T البشرية المصممة بتقنية CRISPR. J. Vis. Exp. (2021).

يوضح هذا الفيديو اختبارا لإجراء تحرير الجينات في الخلايا التائية البشرية باستخدام تقنية CRISPR-Cas9. يتم دمج مزيج من الخلايا التائية الأولية CD4 + و CD8 + مع مركب البروتين النووي الريبي CRISPR-Cas9 ، الذي يستهدف جينات معينة بالضربة القاضية. عند التثقيب الكهربائي ، يوجه sgRNA Cas9 إلى تسلسل الحمض النووي المستهدف ، مما يؤدي إلى إجراء تخفيضات دقيقة. ثم يتم إصلاح هذه الجروح بواسطة آلية الانضمام الطرفية غير المتجانسة للخلية ، مما يؤدي إلى خروج المغلوب الجيني.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

< p class = "jove_title" >1. تصميم sgRNAs واضطراب الجينات في الخلايا التائية البشرية الأولية

1. تصميم كريسبر sgRNA
   ملاحظه: تسهل العديد من الخوادم والبرامج تصميم RNAs أحادية التوجيه (sgRNA) الخاصة بالهدف. في هذا البروتوكول ، تم تصميم sgRNAs ذات التكرارات المتجانسة القصيرة المتباعدة بانتظام (CRISPR) باستخدام CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no) ، وبوابة تصميم gRNA من معهد برود (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
   1. لكل جين مستهدف ، صمم ستة إلى عشرة تسلسلات sgRNA لاستهداف تسلسلات exon المشفرة المبكرة.
      ملاحظة: يجب أن يكون للحمض النووي الريبي المرسال فعالية عالية على الهدف وفعالية منخفضة خارج الهدف. تعمل كل خوارزمية تعلم آلي لتحديد فعالية sgRNA بشكل مختلف قليلا. لذلك ، يوصى بمقارنة أدوات تصميم sgRNA متعددة وتنظيم قائمة من ستة إلى عشرة sgRNA للفحص.
2. اضطراب الجينات في الخلايا التائية البشرية الأولية
   1. الحصول على خلايا الدم المحيطية أحادية النواة الذاتية (PBMC's) من متبرعين متطوعين أصحاء. يتم وصف الجدول الزمني التخطيطي للبروتوكول في الشكل 1 أ وموضح أدناه.
   2. عزل الخلايا التائية CD4 + و CD8 + باستخدام مجموعات اختيار CD4 و CD8 المتوفرة تجاريا.
   3. اجمع بين الخلايا التائية CD4 + و CD8 + بنسبة 1: 1 واحتضانها طوال الليل عند 3 × 10⁶ خلايا / مل في R10 مكملة ب 5 نانوغرام / مل من الإنترلوكين البشري -7 (huIL-7) والإنترلوكين البشري -15 (huIL-15) لكل منهما. يوصى بإضافة IL-7 و IL-15 حيث من المعروف أنهما يعززان النمط الظاهري للذاكرة المركزية والخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري (CAR) -T الممتدة مع IL-7 و IL-15 تتمتع بفعالية فائقة في مكافحة الورم مقارنة بخلايا CAR-T الموسعة إنترلوكين -2 (IL-2).
   4. في اليوم التالي ، عد الخلايا التائية وأجهزة الطرد المركزي 5-10 ×^{10 6} خلايا عند 300 × جم لمدة 5 دقائق. أعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من محلول النواة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (جدول المواد).
   5. أثناء غسل الخلايا ، قم بإعداد مركب البروتين النووي الريبي (RNP) مع البروتين 9 المرتبط بكريسبر (Cas9) و gRNA عن طريق احتضان 10 ميكروغرام من نوكلياز Cas9 مع 5 ميكروغرام من sgRNA لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). النسبة المولية ل Cas9 إلى sgRNA هي 1: 2.4. يوصى باستخدام عنصر تحكم وهمي يحتوي على Cas9 ومحسن للتثقيب الكهربائي ، ولكن لا يحتوي على sgRNA.
      ملاحظه: يمكن إجراء تحرير الجينات المتعددة في هذه الخطوة عن طريق عمل مجمعات RNP لكل هدف على حدة ودمجها مع الخلايا في وقت النواة ، كما هو موضح في الخطوة التالية. يعد اختيار الكواشف لتجميع مجمع RNP أمرا أساسيا للحصول على كفاءة عالية بالضربة القاضية (KO). على سبيل المثال ، نوكليازات Cas9 من بائعين مختلفين لها تأثيرات متفاوتة خارج الهدف ، ويقلل gRNA المعدل كيميائيا من سمية الخلايا التائية ، وبالتالي زيادة كفاءة KO.
   6. اجمع بين الخلايا المعلقة من الخطوة 1.2.4 مع مركب RNP من الخطوة 1.2.5 وأضف 4.2 ميكرولتر من محسن التثقيب الكهربائي 4 ميكرومتر (قليل النوكليوتيد أحادي الشريطة [ssDNA] غير متماثل للجينوم البشري). تخلط جيدا وتنقل إلى كوفيت التثقيب الكهربائي. تجنب الفقاعات لأنها تضعف كفاءة التثقيب الكهربائي.
   7. الخلايا الكهربائية باستخدام رمز النبض EH111. بعد التثقيب الكهربائي ، احتضان الخلايا في R10 مكملة ب 5 نانوغرام / مل huIL-7 و huIL-15 عند 5 × 10⁶ خلايا / مل عند 30 درجة مئوية لمدة 48 ساعة في ألواح 12 بئر. بعد 48 ساعة ، تابع تنشيط الخلايا التائية وتوسيعها.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1. توسيع خلايا CAR-T المعدلة ومضاعفة عدد أعصابها. (أ) الجدول الزمني لتحرير وتصنيع كريسبر في خلايا العربة البشرية الأولية. (ب) مضاعفة عدد السكان في خلايا CD19 CAR-T الوهمية والمحررة بتقنية CRISPR باستخدام عداد كولتر أثناء توسيع خلايا CAR-T (ن = 3 متبرعين أصحاء؛ KO = ضربة قاضية) (C) حجم الخلية (μm3) تم قياسه باستخدام ع...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 4D- الوحدة الأساسية ذات العوامل النووية لونزا AAF-1002B 4D- الوحدة X ذات العوامل النووية لونزا AAF-1002X معززات Cas9-Electroporation آي دي تي 1075915 طقم عزل الخلايا التائية CD4 + تقنيات الخلايا الجذعية 15062 طقم عزل الخلايا التائية CD8 + تقنيات الخلايا الجذعية 15063 كورنينج 0.45 ميكرون فراغ فلتر / زجاجة كورنينج 430768 قارورة زراعة الخلايا Corning T150 ميليبور سيجما CLS430825 مجموعة DNAeasy للدم والأنسجة كياجين 69504 مكمل جلوتاماكس ثيرموفيشر 35050061 هيبس (1 م) ثيرموفيشر 15630080 huIL-15 بيبروتك 200-15 huIL-7 بيبروتك 200-07 ليبوفيكتامين 2000 ثيرموفيشر 11668019 أوبتي-ميم ثيرموفيشر 31985062 P3 الخلية الأولية 4D-nucleofactor X Kit L لونزا V4XP-3024 البنيسيلين - الستربتومايسين - الجلوتامين ثيرموفيشر 10378016 RPMI1640 ثيرموفيشر 12633012 sgRNA آي دي تي جاسوس فاي كاس9 الديفرون 9214 ريال