توليد نموذج فأر BLT مزدوج (نخاع العظام والكبد والغدة الصعترية)

الملخص

المصدر: Daharsh، L. et al. ، نموذج فئران BLT مزدوج متوافق مع البشر يتميز بميكروبيوم الأمعاء المستقر الشبيه بالإنسان وجهاز المناعة البشري.J. Vis. Exp. (2019)

يوضح هذا الفيديو طريقة توليد فأر BLT مزدوج (نخاع الكبد والغدة الصعترية) مع نظام مناعة بشري وظيفي وميكروبيوم أمعاء مستقر يشبه الإنسان.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

فئة

1. إسكان الفئران وصيانتها

1. قم بشراء فئران NSG البالغة من العمر 6-8 أسابيع (NOD.Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Wjl / SzJ).
2. قم بإسكان الفئران في ظروف SPF باستخدام تبادل الهواء والمرشحات المسبقة ومرشحات الهواء الجسيمات عالية الكفاءة (HEPA) (0.22 ميكرومتر) في غرفة ذات درجة حرارة ورطوبة وضغط يتم التحكم فيها.
   1. قم بتخزين الفئران وصيانتها في أقفاص معقمة فردية معقمة في نظام رف قادر على إدارة تبادل الهواء باستخدام المرشحات المسبقة ومرشحات HEPA (0.22 ميكرومتر).
3. قم بإجراء جميع الإجراءات والتلاعب بالفئران في غطاء دخان السلامة البيولوجية من الفئة الثانية من النوع A2 الذي تمت معالجته مسبقا بنسبة 70٪ من الإيثانول. قبل العمل في غرفة ، استحم وقم بالتغيير إلى مقشرات نظيفة ، وبدلة Tyvek ، وأغطية الأحذية ، وقبعة الشعر ، وقناع الوجه ، والقفازات. ارتد ثوب الجراحة فوق بدلة Tyvek أثناء العمليات الجراحية.
   ملاحظه: يفضل أيضا إزالة التلوث بالأشعة فوق البنفسجية (UV) قبل الإجراءات.
   قم
   1. بالتعقيم جميع الأدوات والكواشف إن أمكن ، ثم قم بتطهيرها قبل نقلها إلى غطاء الدخان.
   2. أثناء الإجراءات ، قم بإزالة أقفاص ذات التهوية الفردية من الرف وتطهيرها قبل نقلها إلى غطاء الدخان.
4. قم بإطعام الفئران نظاما غذائيا مشعا ووفر الماء المعقم. قم بتوفير الطعام المشع والمكملات الغذائية الإضافية المشععة حسب الحاجة. قم بتغيير الماء المعقم أسبوعيا أو حسب الحاجة.
   ملاحظه: يمكن أيضا استخدام الماء المحمض المعقمات. كان للنظام الغذائي المشع المقدم مدة صلاحية 6 أشهر بعد التصنيع.

< p class = "jove_title" >2. توليد الفئران المتوافقة مع البشر في نخاع العظام والكبد والغدة الصعترية (BLT)

ملاحظة: تم وصف جيل الفئران hu-BLT سابقا.

1. في يوم الجراحة ، أعط الفئران تشعيعا لكامل الجسم بجرعة 12 سم / غرام من وزن الجسم.
2. جهز الفئران للجراحة.
   1. أعط كل فأر مشعع مزيجا من الكيتامين بتركيز عمل 100 مجم / كجم والزيلازين بتركيز 12 مجم / كجم ، والذي تراوح بين 130-170 ميكرولتر لكل فأر بناء على وزن الجسم عن طريق الحقن داخل الصفاق (IP) للتخدير. لتحضير 3 مل من خليط الكيتامين والزيلازين ، أضف 0.27 مل من الكيتامين بتركيز مخزون 100 مجم / مل و 0.03 مل من الزيلازين بتركيز 100 مجم / مل إلى 2.7 مل من محلول ملحي معقم واخلطه جيدا. تطهير الجلد ب 70٪ أيزوبروبانول قبل الحقن.
   2. أعط كل فأر مشع بوبرينورفين 1 ملغ/كجم من وزن الجسم (نصف عمر 72 ساعة، SR-LAB) عن طريق الحقن تحت الجلد لإدارة الألم على المدى الطويل.
   3. أعط كل فأر مشعع 100 ميكرولتر (858 ميكروغرام) من سيفازولين عن طريق حقن IP للوقاية من المضادات الحيوية قبل الجراحة.
   4. حلق شعر الفئران باستخدام مقصات الشعر الكهربائية حول الجانب الأيسر الجانبي والإنسي من الفأر في موقع الجراحة اللاحق المستخدم لكشف الكلية اليسرى.
   5. تحقق من المستوى المناسب للتخدير عن طريق منعكس الدواسة (قرصة إصبع القدم الثابتة).
   6. أعط غاز الأيزوفلوران بنسبة 3-5٪ إذا كانت هناك حاجة إلى تخدير إضافي في أي وقت أثناء الجراحة.
   7. ضع مرهم العين على كلتا العينين لمنع جفاف القرنية. ضع علامة الأذن إذا لزم الأمر.
3. إجراء عملية جراحية لزرع أنسجة الكبد والغدة الصعترية في كبسولة الكلى اليسرى.
   1. تطهير الجلد في موقع الجراحة عن طريق تطبيق مقشر اليود بدءا من مركز موقع الجراحة والتحرك نحو الخارج بطريقة دائرية. كرر هذه العملية مع 70٪ من الأيزوبروبانول ومرة ثالثة مع اليود.
   2. باستخدام الملقط ، قم أولا بتحميل جزء من أنسجة كبد الجنين البشري في مبزل. ثم باستخدام الملقط ، قم بتحميل جزء واحد من أنسجة الغدة الصعترية للجنين البشري في المبزل. ثم باستخدام الملقط ، قم بتحميل جزء آخر من أنسجة كبد الجنين البشري في المبزل. يجب قطع الأنسجة إلى 1-1.6 مم³ لتناسب الأبعاد الداخلية للمبزل.
   3. استخدم الملقط لرفع الجلد واستخدم المقص لعمل قطع صغير طوليا. قم بتمديد القطع إلى 1.5-2 سم في الجانب الأيسر من الماوس.
   4. استخدم الملقط لرفع طبقة العضلات واستخدم المقص لعمل قطع صغير طوليا. قم بتمديد الجرح حسب الحاجة لكشف الكلى.
   5. كشف الكلى عن طريق الإمساك بالأنسجة الدهنية المحيطة بالكلى برفق. لا تلمس حمة الكلى مباشرة.
   6. قم بعمل شق 1-2 مم في الطرف الخلفي من كبسولة الكلى باستخدام مشرط.
   7. أدخل المبزل المحمل مسبقا ببطء من خلال الشق الموازي للمحور الطويل للكلية وحرر الأنسجة بين كبسولة الكلى والكلى.
   8. أعد الكلى والأمعاء بعناية إلى وضعها الطبيعي. استخدم خيوط 5/0 P-3 (P-13) قابلة للامتصاص بإبرة دائرية مقاس 13 مم 3/8 لإغلاق طبقة العضلات والدبابيس الجراحية لإغلاق الجلد.
4. بعد الجراحة ، ضع الفأر في قفص معقم نظيف للتعافي.
   1. لتقليل فقد الحرارة أثناء التعافي بعد الجراحة ، ضع القفص الذي يحتوي على الفئران على وسادة تسخين متصلة بمضخة مياه تعمل على تسخين المياه وتدويرها.
   2. راقب الفئران حتى تستعيد وعيها الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي.
5. في غضون 6 ساعات من الانتهاء من الجراحة ، عن طريق الوريد الذيل ، قم بحقن الخلايا الجذعية المكونة للدم CD34 + المعزولة من أنسجة الكبد الجنينية البشرية.
   1. قم بتسخين الفئران بمصباح حراري. تطهير الذيل ب 70٪ من الأيزوبروبانول ثم حقن 1.5 إلى 5 × 10 5 خلايا جذعية / 200 ميكرولتر في الوريد الذيلي.
   2. أوقف أي نزيف من الحقن وأعد الفئران إلى قفص العزل الدقيق وقفص العزل الدقيق إلى رف القفص. < / > ملاحظه: عادة ما يتم إيواء فئران ما بعد الجراحة معا ، خمسة لكل قفص عازل دقيق ، أثناء وبعد التعافي. ومع ذلك ، لا يتم إيواء الفئران معا إلا إذا خضعت جميعا لعملية جراحية في نفس اليوم.
6. افحص الفئران يوميا. راقب الدبابيس الجراحية بعناية واستبدلها حسب الحاجة. راقب الفئران عن كثب بحثا عن أي علامة على العدوى أو الانزعاج. قم بتزويد الطعام المعقم على أرضية قفص العزل الدقيق لبضعة أيام بعد الجراحة.
7. قم بإزالة الدبابيس الجراحية بعد 7-10 أيام من الجراحة. أعط غاز الأيزوفلوران بنسبة 3-5٪ لتخدير الفئران. قم بإزالة الدبابيس بعناية ثم ضع المضادات الحيوية ومرهم مسكن للألم على الموقع.
8. اترك 9-12 أسبوعا لإعادة تكوين الخلايا المناعية البشرية ، ثم اجمع الدم المحيطي من الوريد الصافن الإنسي من كل من الفئران المتوافقة مع البشر.
   1. كبح جماح الفئران الواعية باستخدام مقعد مخروطي بلاستيكي بحجم مناسب مع فتحة بالقرب من رأس الفأر للتنفس وفتحة بالقرب من الجزء الخلفي من الفأر لعزل ساق واحدة. ضع الفئران في رأس مخروط التقييد أولا ثم اسحب ساق واحدة برفق من خلال فتحة الساق.
   2. رش الجانب الإنسي من الساق المعزولة بنسبة 70٪ من الأيزوبروبانول ، ثم انشر المضاد الحيوي ومرهم مسكن للألم على نفس الموقع. < / > ملاحظه: يساعد المرهم على الكشف عن موقع الوريد دون الحاجة إلى إزالة الشعر ويساعد أيضا في تكوين قطرات الدم.
   3. باستخدام إبرة قياس 25 بزاوية 90 درجة ، قم بثقب الوريد واجمع 50-100 ميكرولتر من الدم باستخدام أنبوب جمع الدم المطلي بحمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA). أوقف النزيف عن طريق الضغط على الموقع بشاش معقم. بمجرد توقف النزيف ، أعد الفئران إلى قفصها.
      ملاحظه: عادة ما يكون الحد الأقصى لأحجام الدم التي يتم جمعها 50 ميكرولتر في الأسبوع أو 100 ميكرولتر كل أسبوعين.
   4. استخدم الدم المحيطي الذي تم جمعه لاختبار مستوى إعادة تكوين الخلايا المناعية البشرية باستخدام قياس التدفق الخلوي مع الأجسام المضادة ل hCD45 و mCD45 و hCD3 و hCD4 و hCD8 و hCD19.

< ص الفئة = "jove_title" >3. العلاج بالمضادات الحيوية

1. قبل العلاج بالمضادات الحيوية ، اجمع عينات البراز قبل العلاج. انقل الفئران إلى قفص معقم جديد معقم
.
2. قم بإعداد مزيج طازج من المضادات الحيوية واسعة الطيف يوميا.
   1. تحضير 250 مل من الماء الذي يحتوي على ميترونيدازول طازج (1 جم / لتر) ، نيومايسين (1 جم / لتر) ، فانكومايسين (0.5 جم / لتر) ، وأمبيسلين (1 جم / لتر) لكل قفص عازل دقيق من الفئران.
      ملاحظه: استخدم الماء المعقم أو المعقم لمياه الشرب المكملة بالمضادات الحيوية.
   2. أضف 9.2 جم من مزيج المشروبات المحلاة بسكر العنب إلى 250 مل من الماء المكمل بالمضادات الحيوية. < / > ملاحظه: استخدام مزيج المشروبات المحلاة بسكر العنب يخفي الطعم المر للمضادات الحيوية ويساعد على منع الجفاف لدى الفئران.
   3. قم بتغيير المضادات الحيوية وسكر العنب والمشروب المحلى واخلطي الماء المكملة وضع الفئران في قفص جديد معقم يوميا.
      ملاحظه: الفئران متزامنة وتغيير الأقفاص يوميا يمنع الفئران من إعادة تلقيح نفسها ببكتيريا الأمعاء.
   4. للحصول على أقصى قدر من النقش لميكروبيوم الأمعاء الشبيه بالإنسان ، قم بتوفير المضادات الحيوية لمدة 14 يوما. أثناء العلاج بالمضادات الحيوية ، راقب الفئران لفقدان الوزن والجفاف. من المتوقع فقدان الوزن خلال أول 3-4 أيام والهضاب بعد ذلك طوال مدة العلاج. في حالة حدوث الجفاف ، أعط الفئران محلول ملحي أو محلول Ringers عن طريق الحقن داخل الصفاق.
      ملاحظه: تتطلب بروتوكولات أنسنة ميكروبيوم الأمعاء الأخرى تزقيم المضادات الحيوية عن طريق الفم. على الرغم من فعاليتها في استنفاد بكتيريا أمعاء الفئران ، وجدنا أن الطريقة الأقل توغلا لإضافة المضادات الحيوية إلى مياه الشرب تضع ضغطا أقل على الفئران المتوافقة مع البشر وأدت إلى نتائج أفضل.

< p class = "jove_title" >4. عينات المتبرعين وزرع البراز

1. تحضير عينات براز المتبرع البشري.
   1. استخدم مصادر معدة بشكل صحيح لمواد زرع الجراثيم البرازية (FMT) لزرع البراز في الفئران المتوافقة مع البشر.
   2. قم بإذابة مستحضرات FMT وتناولها في ظروف لاهوائية في غرفة لاهوائية.
   3. إذا رغبت في ذلك ، في هذه الخطوة ، امزج أجزاء متساوية من عينات البراز معا لإنشاء عينة "بشرية" غير متحيزة.
   4. حافظ على تجميد وذوبان مادة FMT إلى الحد الأدنى ، إذا لم تكن هناك حاجة إلى نقل العينات أو خلطها ، فقم بإذابة الثلج مباشرة قبل الإجراء.
2. زرع البراز البشري
   1. بعد الانتهاء من 14 يوما من المعالجة بالمضادات الحيوية ، قم بتغيير مياه الشرب إلى ماء معقم وانقل الفئران إلى قفص جديد معقم. أوقف تغييرات القفص اليومية وقم بتنفيذ جدول تغيير القفص مرة واحدة كل 1-2 أسابيع.
   2. قم بإجراء عمليتين لزرع البراز بعد 24 و 48 ساعة من التوقف عن تناول المضادات الحيوية.
   بعد
   3. 24 ساعة من العلاج بالمضادات الحيوية ، قم بإذابة الكمية المطلوبة من مادة FMT وأعط كل فأر 200 ميكرولتر من مادة FMT عن طريق التزقيم عن طريق الفم. كرر الإجراء مرة أخرى بعد 48 ساعة من المضادات الحيوية.
   4. انشر أي مادة FMT مذابة متبقية أو مذابة على فرو الفئران المتوافقة مع البشر أو على فراش القفص.

المواد