Method Article

توليد لقاح حويصلة غشاء خارجي متعدد التكافؤ

July 8th, 2025

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Feng, R., et al. منصة لقاح الجسيمات النانوية "التوصيل والعرض" تعتمد على حويصلات الغشاء الخارجي التي تعرض مجال ربط مستقبلات SARS-CoV-2. J. Vis. Exp. (2022).

يوضح هذا الفيديو طريقة لتوليد لقاحات حويصلة الغشاء الخارجي متعددة التكافؤ (OMV). يتم نقل خلايا الثدييات للتعبير عن المستضدات الفيروسية المدمجة في علامة SpyTag وعلامة بولي هيستيدين. ثم يتم تنقية هذه المستضدات باستخدام عمود تقارب حمض النيكل والنيتريلوترياتيك (Ni-NTA). يتم خلط المستضد المنقى مع حويصلات الغشاء الخارجي التي تعبر عن بروتين SpyCatcher (SC) المرتبط بالسطح. ترتبط مستضدات متعددة تساهميا ب SpyCatchers عبر SpyTags (ST) ، مما يؤدي إلى إنشاء OMVs تعرض المستضد ، وتعمل كلقاح متعدد التكافؤ.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >1. بناء البلازميد

  1. أدخل تسلسل SpyCatcher الذي يشفر الحمض النووي (الشكل 1) في بلازميد pThioHisA-Cytolysin A (ClyA) المقاوم للأمبيسلين (انظر جدول المواد) بين موقعي BamH I و Sal I لبناء البلازميد pThioHisA ClyA-SC بعد تقرير منشور سابقا.
  2. ربط جين اندماج مجال ربط مستقبلات SpyTag-SARS-CoV-2 (RBD) -علامة بولي هيستيدين (Histag) المركب (الشكل 1) في بلازميد pcDNA3.1 (انظر جدول المواد) بين موقعي BamH I و EcoR I لبناء البلازميد pcDNA3.1 RBD-ST بعد تقرير منشور سابقا.
< p class = "jove_title" >2. إعداد OMV-SC

  1. قم بإجراء تحويل ClyA-SC باتباع الخطوات أدناه.
    1. أضف 5 ميكرولتر من محلول البلازميد pThioHisA ClyA-SC (50 نانوغرام / ميكرولتر) إلى 50 ميكرولتر من سلالة BL21 المختصة ، وانفخ برفق ، واتركه يبرد على الثلج لمدة 30 دقيقة.
    2. ضع المحلول لمدة 90 ثانية في الحمام المائي عند 42 درجة مئوية ، ثم ضع المحلول المختلط على الفور على الثلج لمدة 3 دقائق.
    3. أضف 500 ميكرولتر من وسط Luria-Bertani (LB) إلى المعلق البكتيري ، وبعد الخلط ، قم بالزراعة عند 220 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    4. قم بوضع كل التحول على صفيحة أجار LB تحتوي على أمبيسلين (100 ميكروغرام / مل ، انظر جدول المواد) وزراعتها طوال الليل عند 37 درجة مئوية
      ملاحظه: في التجارب اللاحقة ، تم الاحتفاظ بالأمبيسلين بنفس التركيز في الوسط. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقد يتسبب ذلك في فقدان البلازميدات في البكتيريا.
  2. لإنتاج OMV-SC، قم بتنفيذ الخطوات أدناه.
    1. اعزل مستعمرة واحدة من اللوحة (الخطوة 2.1.4) إلى 20 مل من وسط LB (مقاوم للأمبيسيلين) وزراعته طوال الليل عند 220 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية.
    2. تلقيح المحلول البكتيري (من الخطوة 2.2.1.) في وسط 2 لتر ، والزراعة عند 220 دورة في الدقيقة ، 37 درجة مئوية لمدة 5 ساعات حتى مرحلة النمو اللوغاريتمي (OD600نانومتر بين 0.6 إلى 0.8).
    3. عندما يصل OD عند 600 نانومتر من المحلول البكتيري إلى 0.6-0.8 ، أضف الأيزوبروبيل بيتا-D-thiogalactopyranoside (IPTG ، انظر جدول المواد) لجعل التركيز النهائي للمحلول البكتيري 0.5 ملي مولار ، ثم استزراعه بين عشية وضحاها عند 220 دورة في الدقيقة عند 25 درجة مئوية.
  3. قم بتنقية OMV-SC.
    1. جهاز الطرد المركزي للمحلول البكتيري عند 7,000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
    2. قم بتصفية المادة الطافية باستخدام مرشح غشائي 0.22 ميكرومتر ، ثم قم بتركيزه باستخدام غشاء ترشيح فائق 100 كيلو دالتون أو عمود ألياف مجوف (انظر جدول المواد).
    3. قم بتصفية المركز من خلال مرشح غشائي 0.22 ميكرومتر ، ثم قم بطرده عند 150.000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة ساعتين باستخدام جهاز طرد مركزي فائق (انظر جدول المواد) ، وتخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة.
    4. أعد تعليق هطول الأمطار باستخدام PBS وقم بتخزينه عند -80 درجة مئوية. يمكن أن يحافظ المحلول على ثبات طويل الأمد عند -80 درجة مئوية.

3. إعداد RBD-ST

  1. قم بإجراء تعداء RBD-ST باتباع الخطوات أدناه.
    1. حدد نظام تعبير حقيقيات النواة المناسب (على سبيل المثال ، HEK293F) وقم بزراعة الخلايا طوال الليل عند 130 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية بعد التعافي.
    2. أضف 20 ميكرولتر من محلول الخلية HEK293F إلى عداد الخلايا الآلي (انظر جدول المواد) ، وسجل عدد الخلايا ، واضبط التركيز على 1 × 106 خلية / مل ، ثم زرع الخلايا عند 130 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات.
    3. قم بتصفية بلازميد RBD-ST من خلال مرشح غشائي 0.22 ميكرومتر ، وأضف 300 ميكروغرام من البلازميدات إلى وسط زراعة الخلية (انظر جدول المواد) حتى يصبح الحجم النهائي 10 مل ؛ رج العبوة لمدة 10 ثوان.
    4. قم بتسخين البولي إيثيلينيمين (PEI ، 1 مجم / مل ، انظر جدول المواد) إلى 65 درجة مئوية في الحمام المائي ، واخلط 0.7 مل من PEI مع 9.3 مل من وسط زراعة الخلايا ، ورجها بشكل متقطع لمدة 10 ثانية < / > ملاحظه: لا تهز المحلول بقوة. خلاف ذلك ، قد تؤثر الفقاعات الناتجة على كفاءة التعداد.
    5. أضف محلول البلازميد إلى محلول PEI ، ورج الخليط بشكل متقطع لمدة 10 ثوان ، واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    6. يضاف الخليط إلى 280 مل من وسط زراعة الخلايا ويزرعه عند 130 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية لمدة 5 أيام.
  2. قم بإجراء تنقية RBD-ST.
      قم
    1. بالطرد المركزي للخلايا عند 6,000 × جم عند 25 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة واستخدم ماصة لجمع المادة الطافية.
    2. املأ العمود ب 2 مل من Ni-NTA agarose (انظر جدول المواد) واغسله 3x باستخدام 3x PBS.
    3. أضف إيميدازول (انظر جدول المواد) إلى المادة الطافية للخلية لجعل التركيز النهائي 20 ملي مولار ، وقم بتحميل المادة الطافية للخلية 2x.
    4. أضف 3 أحجام أعمدة (CV) من PBS تحتوي على 20 ملي مولار من إيميدازول للغسيل ، واجمع جزء الغسيل.
    5. تدرج التدرج مع 3 سيرة ذاتية من PBS تحتوي على تركيزات منخفضة إلى عالية (على سبيل المثال ، 0.3 م ، 0.4 م ، 0.5 م) من إيميدازول ؛ تتخلص 2x لكل تركيز.
    6. استخدم SDS-PAGE لتحديد RBD-ST في تدرجات تركيز مختلفة.
فئة

4. الاقتران الحيوي والتنقية OMV-RBD

  1. حدد تركيز البروتين بطريقة مقايسة حمض البيسنكونينيك (BCA) (انظر جدول المواد).
    1. قم بتخفيف محلول بروتين ألبومين مصل الأبقار القياسي (BSA) بشكل متسلسل من 2 مجم / مل إلى 0.0625 مجم / مل ، وقم بتخفيف OMV-SC و RBD-ST المنقى 10x ، ثم اخلط محاليل عمل BCA A و B (المتوفرة في مجموعة الفحص) بنسبة 50: 1 (حجم / حجم).
    2. يضاف محلول البروتين المخفف (25 ميكرولتر / بئر) ويخلط مع محلول عمل BCA (200 ميكرولتر / بئر) ؛ احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    3. قم بقياس الامتصاص (OD) عند 562 نانومتر من كل بئر واحسب تركيز البروتين من المنحنى القياسي.
  2. قم بإجراء الاقتران الحيوي ل OMV-SC و RBD-ST باتباع الخطوات أدناه.
    1. امزج OMV-SC و RBD-ST في PBS بنسبة 40: 1 (وزن / وزن).
    2. قم بالتدوير عموديا لخلط الخليط طوال الليل عند 15 دورة في الدقيقة عند 4 درجات مئوية
      ملاحظه: قد تتفاعل المستضدات المختلفة بنسب مختلفة. يمكن للمرء أن يجرب نسب تفاعل مختلفة بناء على خصائص المستضد.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >figure-results-1
الشكل 1: تسلسلات البلازميد المستخدمة في هذه الدراسة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Materials

List of materials used in this article Name Company Catalog Number Comments أمبيسلين الصوديوم سانغون للتكنولوجيا الحيوية A610028 عداد الخلايا الآلي كونت ستار التكنولوجيا الحيويه مجموعة قياس بروتين BCA CWBIO CW0014S جهاز الرحلان الكهربائي كافوي الطاقة BV أجهزة الطرد المركزي عالية السرعة للتجميد بيوريدج H2500R ماوس His-Tag mAb تقنية إشارات الخلية 2366 ثانية إيميدازول سانغون للتكنولوجيا الحيوية A600277 الأيزوبروبيل بيتا-د-ثيوغالاكتوبيرانوسيد سانغون للتكنولوجيا الحيوية A600118 Ni-NTA His-Bind Superflow كياجين 70691 OPM-293 وسط زراعة الخلايا أوبم للعلوم البيولوجية 81075-001 pcDNA3.1 RBD-ST البلازميد علم الوراثة ووهان البيولوجية محلول ملحي عازل للفوسفات ZSGB-bio ZLI-9061 بولي إيثيلينيمين خطي العلوم المتعددة 23966-1 سلم البروتين الملون مسبقا الحراريه هاتف: 26616 pThioHisA ClyA-SC البلازميد علم الوراثة ووهان البيولوجية أنظمة منضدة Quixstand (عمود ألياف مجوف 100 كيلو دالتون) جنرال إلكتريك للرعاية الصحية المخزن المؤقت للتحميل SDS-PAGE (5x) بيوتيم P0015 كلوريد الصوديوم سانغون للتكنولوجيا الحيوية A100241 أداة التعليق تقنية الحياة خلاط الهولا التربتون أوكسويد LP0042B جهاز طرد مركزي فائق بيكمان كولتر إكس بي إن -100 مقياس الطيف الضوئي بالأشعة فوق البنفسجية هيتاشي [أو-3900] مستخلص الخميرة سانغون للتكنولوجيا الحيوية A610961

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Outer Membrane VesiclesSpyTag SpyCatcherAntigen PurificationNi NTA AffinityOMV VaccineProtein ConcentrationBCA MethodUltracentrifugationHEK293F CellsBioconjugation

Related Articles