نموذج تداخل الأبهر للفأر لدراسة رفض الأوعية الدموية الناجم عن الخيوط المناعية

Abstract

المصدر: Enns، W.، et al. نموذج الفأر لرفض الأوعية الدموية الناجم عن الخياف المناعية وزرع تصلب الشرايين. J. Vis. Exp. (2015).

يوضح هذا الفيديو طريقة لإنشاء نموذج تداخل الأبهر للفأر لدراسة رفض الأوعية الدموية الناجم عن الخيوط المناعي. بعد وضع فأر متبرع مخدر في وضع الاستلقاء ، يتم عزل الشريان الأورطي البطني تحت الكلوي (IAA) بعناية عن الهياكل المحيطة. يتم ربط الأوعية المتفرعة ، ويتم تثبيت طرفي IAA لمنع تدفق الدم قبل الاستئصال. بعد ذلك ، يتم زرع IAA المتبرع في فأر متلقي خيفي ، ويتم استعادة تدفق الدم من خلال مفاغرة التحقيق في رفض الأوعية الدموية الناجم عن الخيف.

Protocol

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

استخدم الفئران المانحة Balb / cYJ (H2^d) والفئران المتلقية C57Bl / 6 (H2^b) لفحص التفاعلات الخيفية. تستخدم الفئران في التجارب التي تتراوح أعمارها بين 8 إلى 12 أسبوعا. استخدم الفئران الإناث أو الذكور. تتكون الضوابط الزاوية من أجزاء الأبهر من المتبرعين C57Bl / 6 إلى متلقي C57Bl / 6.

1. إعداد المتبرع والمتلقي

ملاحظة: يتم تخدير كل من المتبرع والمتلقي وإعداده قبل الجراحة لتقليل نقص تروية الطعم. تستخدم التخدير عن طريق الحقن في البروتوكول لمنع انسداد بواسطة المعدات اللازمة لتوصيل التخدير المستنشق. ومع ذلك ، إذا رغبت في ذلك ، فإن التخدير المستنشق هو البديل المناسب. من الحقن الأولي لأدوية التخدير ، يستغرق الإجراء بأكمله حوالي 90 دقيقة حتى يكتمل. الوقت الإقفاري للكسب غير المشروع أقل من 30 دقيقة.

1. تخدير الفأر بالحقن داخل الصفاق من الكيتامين (100 ملغ/كغ؛ 10 ملغ/مل) والزيلازين (10 ملغ/كغ؛ 1 ملغ/مل). سيتم تخدير الماوس في غضون 10 إلى 15 دقيقة. قم بتقييم عمق التخدير عن طريق الضغط على الجزء الدهني من وسادة قدم. قم بإدارة 1/3 من الجرعة الأصلية من كوكتيل التخدير ، حسب الحاجة ، حتى لا يظهر منعكس الانسحاب. راقب معدل التنفس عن كثب بعد تناول كل كوكتيل. أثناء الجراحة ، قم بتقييم مستوى التخدير كل 15 دقيقة عن طريق الضغط على جدار البطن الأمامي بزوج من الملقط. يجب أن تظل الفئران مخدرة بعمق لمدة 60 إلى 90 دقيقة.
قم
2. بتليين عيون الفأر بمرهم للعيون لمنع الجفاف أثناء التخدير.
3. حلق الشعر بالقرب من الجلد قدر الإمكان في المنطقة البطنية البطنية من منتصف الصدر إلى العانة. احرص بشكل خاص على عدم تقطيع أي جلد. لا تستخدم كريم إزالة الشعر لأنه قد يمتص الجلد ويمكن أن يكون التهابيا.
4. ضع على منشفة فوق طاولة التدفئة أو الوسادة.
5. نظف موقع الجراحة بمقشر أولي يحتوي على 2٪ كلوروهيكسيدين. قم بإعداد منطقة عمل كبيرة لتعظيم المجال الجراحي. ابدأ في التنظيف في وسط موقع الجراحة وانتقل إلى الخارج خطيا أو دائريا. تخلص من الشاش. كرر هذا الإجراء 5 مرات أخرى على الأقل. ضع وسادة تحضير الكحول على نفس المنطقة. بمجرد أن يجف الكحول ، قم بإعداد المنطقة النظيفة بمحلول البيتادين ولفها بشاش معقم.

2. إجراء مفاغرة شاملة

1. عملية المانحين
   1. حافظ على تقنية معقمة طوال العملية. نظف جميع أسطح سطح العمل والطاولة الجراحية بمحلول بيروكسيد الهيدروجين المتسارع بنسبة 0.5٪ قبل الاستخدام. لف وتعقيم جميع الأدوات الجراحية والشاشات والستائر والعباءات قبل الاستخدام. تحقق من عقم الأدوات باستخدام شريط مؤشر معقم بالبخار يوضع في كل عبوة. يتم استخدام القفازات الجراحية المعقمة والتخلص منها بين العمليات الجراحية. لعمليات جراحية متعددة ، قم بتعقيم الأدوات الجراحية بين الاستخدامات باستخدام معقم الخرز الزجاجي الساخن.
   2. ضع الفأر المتبرع على لوح زجاجي نظيف ورفيع ملفوف بستارة معقمة تحت مجهر التشغيل بتكبير 8-30X.
   3. بعد التأكد من التخدير الجراحي الكافي كما هو موضح في القسم 1.1 ، تابع الجراحة.
   4. باستخدام مقص معقم ، قم بعمل شق طولي واحد في البطن في خط الوسط السفلي ، من العانة إلى عملية الخفاف.
   5. افتح جدران البطن لفضح التجويف باستخدام ضام صغير.
   6. باستخدام أدوات تطبيق معقمة ذات رؤوس قطنية ، قم بسحب الأمعاء برفق بشكل متفوق على يسار وقم بتغطيتها بشاش مبلل بمحلول ملحي. حرك الأعضاء التناسلية إلى أدنى وحدد موقع الشريان الأورطي تحت الكلوي والوريد الأجوف السفلي (IVC). بلل الأنسجة المكشوفة بشكل دوري بمحلول ملحي.
   7. باستخدام الملقط الطبي رقم 5 ، افصل الشريان الأورطي عن IVC ، من مستوى الشريان الكلوي الأيسر إلى التشعب. استخدم 10-0 خيوط أحادية من مادة البولي أميد لربط الفروع الصغيرة بالقرب من الشريان الأورطي.
   8. بمجرد فصل الشريان الأورطي للمتبرع عن IVC ، قم بتشبع الوعاء بمحلول ملحي ، وقم بتغطية التجويف المكشوف بشاش مبلل ، واترك المتبرع جانبا في منطقة معقمة. تحقق من حالة المتبرع (وظيفة الجهاز التنفسي والقلب والأوعية الدموية وعمق التخدير) كل 15 دقيقة. ابدأ العمل على المستلم، وعزل الشريان الأورطي كما هو موضح أدناه (الخطوات 2.2.1 إلى 2.2.7).
   9. بمجرد فصل الشريان الأورطي المتلقي عن IVC ووضعه جانبا ، أعد المتبرع تحت المجهر. المشبك المتقاطع (القريب والبعيد عن الجزء محل الاهتمام) الشريان الأورطي المتبرع ، على بعد حوالي 5 مم ، مع اثنين من مشابك الأوعية الدموية الدقيقة 4 مم.
   10. باستخدام مقص Vannas-Tubingen ، قم بعمل جزء صغير من الكسب غير المشروع (بطول 3 إلى 4 مم) من الشريان الأورطي البطني.
   11. باستخدام إبرة 25 جم 5/8 متصلة بحقنة ، اغسل الشريان الأورطي المستأصل بمحلول ملحي هيباريني (100 وحدة / مل). تأكد من عدم ملامسة طرف الإبرة للوعاء.
   12. ضع الشريان الأورطي في محلول ملحي هيبارين (100 وحدة / مل) على الثلج واتركه جانبا. بينما لا تزال تحت التخدير العميق ، حرر المشابك الوعائية الدقيقة. القتل الرحيم للمتبرع عن طريق الاستغناء.
   13. زرع الوعاء المتبرع في غضون 30 دقيقة من الاستئصال. على الرغم من أنه من الممكن استخدام وعاء مانح واحد لعدة متلقين عن طريق استئصال طول أكبر من الشريان الأورطي، حافظ على الوقت الإقفاري أقل من 30 دقيقة.
2. عملية المستلم
   1. حافظ على تقنية معقمة طوال العملية ، كما هو الحال في عملية المتبرع.
   2. ضع الفأر المتلقي على لوح زجاجي رفيع ملفوف بستارة معقمة تحت مجهر التشغيل بتكبير 8-30X.
   3. بعد التأكد من التخدير الكافي ، تابع الجراحة عندما لا يظهر منعكس الانسحاب.
   4. باستخدام مقص معقم ، قم بعمل شق طولي واحد في البطن في خط الوسط السفلي ، من العانة إلى عملية الخفاف.
   5. افتح جدران البطن لكشف التجويف باستخدام ضام صغير.
   6. باستخدام أدوات تطبيق معقمة ذات رؤوس قطنية ، قم بسحب الأمعاء برفق بشكل متفوق على يسار وقم بتغطيتها بشاش مبلل بمحلول ملحي. حرك الأعضاء التناسلية بشكل أدنى وحدد موقع الشريان الأورطي تحت الكلوي و IVC. بلل الأنسجة المكشوفة بشكل دوري بمحلول ملحي.
   7. افصل الشريان الأورطي عن IVC ، من مستوى الشريان الكلوي الأيسر إلى التشعب. استخدم 10-0 خيوط أحادية من مادة البولي أميد لربط الفروع الصغيرة بالقرب من الشريان الأورطي إذا لزم الأمر.
   8. المشبك المتقاطع (القريب والبعيد عن الجزء محل الاهتمام) الشريان الأورطي ، على بعد حوالي 5 مم ، مع اثنين من مشابك الأوعية الدموية الدقيقة 4 مم.
   9. باستخدام مقص Vannas-Tubingen المجهري ، قم بعمل بضع الأبهر الأفقي الفردي واستئصال جزء صغير (لا يزيد عن 0.5 مم) من الشريان الأورطي البطني لاستيعاب طعم الأبهر المتبرع.
   10. اغسل الشريان الأورطي المستأصل بمحلول ملحي هيباريني (100 وحدة / مل). يجب أن يكون طعم الأبهر المتبرع بطول مناسب لتوصيل نهايات الأبهر المنقولة للمتلقي.
   11. ضع طعم الأبهر المتبرع في وضع تقويم العظام ومفاغرة نهاية طعم المتبرع حتى نهاية المتلقي ، مع مطابقة الاتجاه التشريحي للكسب غير المشروع مع الاتجاه التشريحي للمتلقي.
   12. أمسك الغلالة الخارجية للوعاء برفق وقم بتثبيتها قليلا باستخدام الملقط الطبي رقم 5. باستخدام الملقط ، قم بدفع الإبرة المتصلة بخيطة الشعيرات الأحادية 10-0 من مادة البولي أميد عبر السماكة الكاملة لجدار الوعاء الدموي لتأمين طعم الأبهر المتبرع بالوعاء المقطوع للمتلقي. تأكد من عدم إغلاق فتحة الوعاء بسبب الخياطة غير المقصودة للجدار الخلفي للوعاء.
   13. بالنسبة للغرز المستمرة، ضع خيوط البقاء عند موضع الساعة 9 في كل من الطرفي العلوي والسفلي من الكسب غير المشروع. بدءا من الطرف العلوي من الكسب غير المشروع من الساعة 3 ، قم بمفاغرة الأطراف المقطوعة ب 2 خيوط تشغيل وتأمين الخيط في خياطة البقاء.
       1. اقلب الكسب غير المشروع واستمر في خياطة الجري إلى الجزء الظهري من الوعاء ، مع تلبية خياطة البقاء الأصلية. آمن دون ممارسة الكثير من الضغط على السفينة. كرر خياطة مفاغرة سفلى.
          ملاحظة: تبدأ الغرز المتقطعة بنفس طريقة الغرز المستمرة ، باستثناء أن الوعاء يتم فغره بثلاث غرز منفصلة بين خيوط الإقامة. عادة ما يكون وقت مفاغرة 20 دقيقة.
   14. بمجرد اكتمال مفاغرة ، حرر مشبك الأوعية الدموية الدقيقة البعيدة للسماح للدم المرتجع بالتدفق والتحقق من تسرب المواقع المفاغرة. إذا كان هناك تسرب ، فضع غرزة على الفور لإغلاق الموقع المعيب. إذا لم يكن هناك نزيف في المواقع ، فحرر المشبك القريب.
   15. افحص عملية الزرع وتأكد من عدم وجود انسداد دموي في الطعم والأجزاء القريبة والبعيدة من وعاء المتلقي. يشير نمط النبض القوي في أوعية المتبرع والمتلقي إلى أن الدم يتدفق بحرية. باستخدام زوج من الملقط ، أمسك أحد طرفي خيوط البقاء برفق وقم بإغلاق الوعاء قليلا لفحص الجدار الخلفي للسفينة.
       ملاحظه: يجب ألا يكون هناك تجعد لجدار الوعاء في طرفي المواقع المفاغرة. ضعف تدفق الدم بعد إزالة المشابك هو علامة على تجلط الدم.
   16. أعد الأمعاء إلى تجويف البطن باستخدام أدوات تطبيق ذات رؤوس قطنية.
   17. باستخدام حامل إبرة Castroviejo وملقط Graefe ، أغلق جدار البطن بخيوط 5-0 من مادة البولي بروبيلين باستخدام خياطة مستمرة. أغلق طبقة الجلد بنفس الغرز باستخدام إغلاق تحت الجلد.
   18. يتم تطبيق التوربوجيزيك (1 ملغ/كغ) فور الانتهاء من عملية الزرع.
   19. أعط على الفور ، بالترتيب ، Atipamezole (1 مجم / كجم) ، كيتوبروفين (5 مجم / كجم) ، ومحلول Lactated Ringer الدافئ تحت الجلد.
   20. بعد الجراحة مباشرة ، ضع الفئران في قفص ساخن تحت بطانية مائية طوال الليل (12 ساعة). خلال فترة التعافي من التخدير ، ضع بمفردها في منطقة نظيفة وجافة وخالية من العوائق. قم بتبطين القفص (المعقم بالتعقيم) بمناشف ورقية نظيفة واضبط درجة حرارة بطانية الماء على حوالي 20 إلى 22 درجة مئوية. توفير طعام جاف ومرطب على أرضية القفص.
       ملاحظه: أحد المكونات الأساسية لرعاية ما بعد الجراحة هو مراقبة والتدخل المناسب ، حسب الحاجة ، أثناء التعافي من التخدير والجراحة. ستختلف شدة المراقبة اللازمة باختلاف وقد تكون أكبر خلال فترة التعافي الفوري من التخدير مقارنة بوقت لاحق في التعافي بعد الجراحة.
   21. راقب التي خضعت للتخدير باستمرار حتى تتعافى تماما. يجب أن يكون قادرا على الحفاظ على الاستلقاء القصي غير المساعد ، ويجب أن يبدو هادئا وخاليا من الألم قبل تركه دون رقابة.
   22. أعط بوبرينورفين (0.1 ملغ/كغ بولي مروري) وكيتوبروفين (5 ملغ/كغ من البولي أكيد الجزيد) لمدة ثلاثة أيام، وكلاهما تحت الجلد.
   23. مراقبة وظائف القلب والأوعية الدموية والجهاز التنفسي ودرجة حرارة الجسم والألم أو الانزعاج بعد الجراحة أثناء التعافي من التخدير لمدة ثلاثة أيام على الأقل. قد تكون هناك حاجة إلى رعاية إضافية، مثل إعطاء المسكنات والأدوية الأخرى والسوائل الحقنية لتقليل الجفاف وفقدان الكهارل.
   24. تقييم نجاح جراحة الزرع من خلال مراقبة الوظيفة الحركية للأطراف الخلفية. يتضمن النجاح الكامل لعملية الزرع تدفق الدم دون عائق إلى الطرف الخلفي والذيل ، والذي يجب أن يكون فوريا عند شفاء ، والشفاء التام دون أي شلل في الأطراف الخلفية في اليوم الثاني.

Materials