التحصين داخل الأنف باستخدام BCG في نموذج الفأر

الملخص

المصدر: Uranga، S. et al.، الفعالية الوقائية والاستجابة المناعية الرئوية بعد إعطاء BCG تحت الجلد وداخل الأنف في الفئران.J. Vis. Exp. (2016)

يوضح هذا الفيديو التحصين ضد BCG داخل الأنف في الفئران ، مما ينشط الاستجابات المناعية الفطرية والتكيفية ، مما يؤدي إلى تطوير خلايا الذاكرة التائية المقيمة في الرئة والخلايا البائية المستجيبة ، وبالتالي تعزيز الحماية ضد عدوى المتفطرة.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. تحضير مخزون الجلسرين الكمي من Bacillus Calmette-Guerin (BCG) الدنماركي والمتفطرة السلية H37Rv

ملاحظة: تم تنفيذ جميع البروتوكولات الموصوفة في ظل ظروف السلامة الحيوية من المستوى 3 (BSL3).

1. قم بإذابة مخزونات الجلسرين المجمدة من سلالات BCG الدنماركية أو H37Rv وتلقيح 100 ميكرولتر في 10 مل من وسط 7H9 مكمل ب Tween-80 0.05٪ (حجم / حجم) و ADC (الألبومين ، سكر العنب ، الكاتلاز) 10٪ (حجم / حجم).
2. احتضان في ظروف ثابتة لمدة أسبوع عند 37 درجة مئوية حتى تصبح الثقافة في مرحلة النمو اللوغاريتمية.
3. قم بتوسيع نطاق الثقافة البكتيرية عن طريق نقل مزرعة 10 مل إلى 200 مل من الوسط الطازج. احتضن لمدة 20 يوما إضافيا في ظل ظروف ثابتة.
4. انقله إلى أنابيب الطرد المركزي سعة 50 مل وأجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة عند 2500 × جم.
5. تخلص من المواد الطافية وأعد تعليق الحبيبات البكتيرية في الحجم المتبقي. أضف حبات زجاجية معقمة بقطر 3 مم لكل أنبوب (10-15 لكل أنبوب).
6. دوامة بقوة لمدة 1 دقيقة من أجل فصل الكتل البكتيرية. أعد تعليق كل حبيبات في 10 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) مع Tween-80 0.05٪ (حجم / حجم).
7. اترك الأنابيب لمدة 10 دقائق للسماح لأكبر الركام البكتيري والخرز الزجاجي بالاستقرار.
8. استرجع 9.5 مل من المادة الطافية من كل أنبوب من الأنابيب الأربعة التي تحتوي على كتل صغيرة وبكتيريا مفردة ونقل الأحجام إلى أنبوب طرد مركزي واحد جديد سعة 50 مل (الحجم النهائي المسترد 38 مل). جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 400 × جم.
9. استرجع 35 مل من المادة الطافية (التي تحتوي بشكل أساسي على بكتيريا مفردة) في أنبوب طرد مركزي واحد جديد سعة 50 مل وأضف 15 مل من PBS مع الجلسرين 50٪ (حجم / حجم) ، للحصول على تركيز نهائي للجلسرين بنسبة 15٪ (حجم / حجم).
10. تخلط بلطف وتوزع في 1 مل في أنابيب مناسبة للتجميد. يحفظ في درجة حرارة -80 درجة مئوية (توفر الدفعة الواحدة ما يقرب من 50 حصة من مخزون الجلسرين).
11. لتحديد مخزون الجلسرين ، قم بإذابة الجلسرين في اليوم التالي للتجميد وإجراء سبعة تخفيفات تسلسلية بمقدار عشرة أضعاف في أنابيب منفصلة سعة 1.5 مل تحتوي على 900 ميكرولتر من PBS.
12. صفيحة 100 ميكرولتر من كل تخفيف في وسط أجار صلب 7H10 مكمل ب ADC 10٪ (حجم / حجم) محضرة في أطباق بتري بقطر 55 مم.
13. أضف حبيبات زجاجية بقطر 3 مم بعناية (حوالي 10 لكل لوحة) ورج اللوحة برفق لتوزيع الحجم بالتساوي على لوحة الأجار. تخلص من الخرز وأغلق لوحة الأجار بالبارافيلم.
14. احتضان لمدة 21 يوما عند 37 درجة مئوية وحدد تركيز البكتيريا عن طريق حساب وحدات تشكيل المستعمرة (CFU) في التخفيفات حيث يمكن تمييز المستعمرات المفردة بدقة.

< p class = "jove_title" >2. تطعيم الفئران

1. قم بإذابة جلسرين BCG المحدد مسبقا وتخفيفه في PBS لتحضير معلقين. احسب الحجم النهائي مع الأخذ في الاعتبار أن الجرعة لكل هي 100 ميكرولتر للإعطاء تحت الجلد (10 ،⁷ CFU لكل مل للتطعيم تحت الجلد) و 40 ميكرولتر للإعطاء داخل الأنف (2.5 × 10⁷ CFU للتطعيم داخل الأنف).
2. استخدم محطة عمل تخدير متخصصة للقوارض لتخدير الفئران بمزيج من الأيزوفلوران والأكسجين. استخدم الأيزوفلوران 5٪ للحث على التخدير و 2٪ للحفاظ على الفئران في غرفة التخدير. (يمكن استخدام طريقة تخدير أخرى مقبولة).
3. لإعطاء اللقاح تحت الجلد، يجب ملء حقنة سعة 1 مل بإبرة 26 جم مع 1 مل من المعلق الجرثومي (10⁷ CFU/ml). قم بإزالة فقاعات الهواء.
4. ضع فأرا مخدرا على سطح مستو في وضع الانبطاح داخل غطاء التدفق الصفحي وقم بتلقيح 100 ميكرولتر (10⁶ CFU/جرعة) من اللقاح تحت الجلد في جناح ظهر الفأر. أعد الماوس إلى القفص وراقبه للتأكد من تعافيه بشكل صحيح من التخدير.
5. قم بتغيير إبرة المحقنة بين كل إدارة فأر. تمت إزالة فقاعات الهواء كما هو موضح أعلاه.
6. للإعطاء داخل الأنف، ضع فأر مخدر في وضع ضعيف داخل الغطاء.
7. باستخدام ماصة دقيقة ، خذ 20 ميكرولتر من المعلق مع 2.5 × 10⁷ CFU / مل. ضع اللقاح قطرة قطرة بين فتحتي الأنف حتى يتم ترسيب الحجم بالكامل ، مع ترك الوقت بين القطرات للسماح للفأر باستنشاق الحجم.
   ملاحظة: يمكن أن تعاني الفئران من ضائقة في الجهاز التنفسي أثناء هذا الإجراء ، لذا يجب تركها لامتصاص كل قطرة قبل إعطاء القطرة التالية لمنعها قدر الإمكان.
8. أعد ملء الماصة الدقيقة ب 20 ميكرولتر أخرى وكرر العملية. إذا بدأ الفأر في الاستيقاظ من التخدير بعد التلقيح الأول ، ضعه في غرفة التخدير قبل التلقيح الثاني. أعد الماوس إلى القفص وتأكد من تعافيه بشكل صحيح من التخدير.

فئة

3. تحدي الفأر داخل الأنف مع سلالة H37Rv

1. قم بإذابة الجلسرين H37Rv المحدد مسبقا وتخفيفه في PBS لتحضير معلق بكتيري يبلغ 2,500 CFU لكل مل. احسب الحجم النهائي مع الأخذ في الاعتبار أن الجرعة لكل هي 40 ميكرولتر.
2. يتم تلقيح H37Rv عن طريق الأنف كما هو موضح في 2.5 - 2.7. جرعة التحدي النهائية لكل فأر هي 10² CFU / 40 ميكرولتر.

المواد