مقالة منهجية

توليد إزالة الميالين القشري الدماغي على نطاق واسع في نموذج الفئران

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Üçal ، M. et al. ، نموذج الفئران لإزالة الميالين القشري الدماغي على نطاق واسع الناجم عن حقن داخل المخ للسيتوكينات المؤيدة للالتهابات. J. Vis. Exp. (2021)

يوضح الفيديو طريقة لإنشاء نموذج للفئران مع إزالة الميالين القشري الدماغي على نطاق واسع. يتضمن ذلك تعطيل الحاجز الدموي الدماغي عن طريق حقن السيتوكينات المؤيدة للالتهابات في الفئران المعدة ببروتين غمد المايلين المؤتلف. تسهل هذه العملية تسلل الخلايا المناعية ، مما يؤدي إلى إزالة الميالين القشري الدماغي على نطاق واسع.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. تحضير المواد

ملاحظة: يتم إجراء الجراحة في ظروف معقمة. قبل البدء ، تأكد من تنظيف جميع الأدوات الجراحية ، بما في ذلك لقم الثقب ، بمطهر مناسب.

  1. تحضير خليط مخدر: 0.02 مجم / مل من الفنتانيل ، و 0.4 مجم / مل من الميدازولام ، و 0.2 مجم / مل من ميديتوميدين (التركيزات النهائية في الخليط). < / > ملاحظة: انظر قسم المناقشة المعني للحصول على التخدير البديل.
  2. تحضير خليط ترياق: 0.07 ملغم/مل من فلومازنيل و0.42 ملغم/مل من الأتيبامزول (التركيزات النهائية في الخليط).
  3. قم بتجميع القسطرة وغطاء القسطرة مع المدخل والمسمار. قطع القسطرة بطول 2 مم بمشرط (الشكل 1).
    ملاحظة: لا تستخدم المقص لهذا الغرض لأنها تضغط وتشوه شكل المقطع العرضي الدائري لطرف القسطرة.
< p class = "jove_title" >2. التحضير الجراحي

  1. تخدير الجرذ عن طريق إعطاء خليط التخدير داخل الصفاق (1.5 مل / كجم من وزن الجسم).
  2. احلق رأس الجرذ بين الأذنين باستخدام ماكينة الحلاقة الكهربائية. ضع بطانية حرارية منزلية على الإطار التجسيمي قبل وضع ، لتجنب انخفاض حرارة الجسم طوال الجراحة.
  3. قم بتثبيت رأس الفئران في الإطار التجسيمي باستخدام قضبان الأذن ولوحة اللدغة ، مما يضمن أن الرأس أفقي ومستقر. تحقق من الثبات عن طريق الضغط على الجمجمة بالإصبع أو الملقط.
    ملاحظة: قد يتسبب التثبيت الفضفاض والوضع غير الأفقي داخل الإطار التجسيمي في حدوث انحراف عن الإحداثيات المقصودة.
  4. ضع قطرات العين المزلقة لمنع جفاف القرنية أثناء الجراحة. قم بتغطية العينين بمادة غير شفافة لمنع أي تعرض جراحي للضوء.
  5. نظف منطقة الحلاقة بالتناوب بين استخدام 70٪ من الإيثانول و 10٪ مركب بوفيدون اليود.
    ملاحظة: اتبع جميع الإجراءات الاحترازية أثناء الجراحة لتجنب العدوى. يتم إجراء الجراحة في ظل ظروف معقمة. إذا تم كسر التعقيم ، فيجب استبدال المادة الملوثة.
< p class = "jove_title" >3. زرع القسطرة

  1. قم بعمل شق طولي بطول حوالي 2 سم في منتصف جلد الرأس. استخدم مشابك البلدغ لتثبيت الجلد على الجانبين. للحصول على نظرة عامة على هذه الخطوات، انظر الشكل 2.
  2. قم بإزالة الدم باستخدام قضيب قطني.
  3. قم بإزالة السمحاق في الجمجمة. نظف المنديل باستخدام قضيب القطن وكشف عظم الجمجمة. اترك الجمجمة تجف لمدة 1 دقيقة.
  4. تحديد المعالم التشريحية ، Lambda ، Bregma ، والخياطة الإنسية. مع تثبيت المثقاب على الإطار التجسيمي ، ضع طرف الحفر في Bregma كنقطة بداية. تحرك 2 مم للخلف من Bregma وتحرك ~ 2.4 مم بشكل جانبي إلى الخيط الإنسي.
  5. قم بحفر ثقب قطره 0.5 مم للقسطرة في هذا الموضع. انفخ برفق أي غبار عظمي.
    ملاحظة: من المهم أن تظل الأم الجافية سليمة أثناء الحفر. لضمان ذلك ، 1) استخدم مثقابا يمكن تثبيته على الإطار التجسيمي ، 2) افحص الثقب بشكل متكرر أثناء الحفر ، و 3) حفر في خطوات صغيرة. إذا تم تطبيق الكثير من الضغط على الجمجمة ، فسيستمر طرف الحفر في الدماغ ويتلفه عند اختراق الجمجمة بالكامل.
  6. قم بحفر 3 ثقوب أخرى (~ 1.3 مم في القطر) لمسامير التثبيت على بعد بضعة ملليمترات من الفتحة الأولى. قم بتفجير غبار العظام برفق.
    ملاحظة: حدد مواقع برغي التثبيت التي توفر مساحة كافية لأعلى القسطرة (قطرها ~2 مم) وأسطح برغي التثبيت (~ 1 مم).
  7. قم بإزالة غبار العظام عن طريق الري بحوالي 1-2 مل من محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS) أو محلول ملحي فسيولوجي باستخدام حقنة. نظف الجمجمة. شد مسامير التثبيت بمقدار 2-3 لفات كاملة.
    ملاحظة: مسامير التثبيت ضرورية لتثبيت الإعداد عن طريق تثبيت الأسمنت السني ، وبالتالي القسطرة في مكانها. أثناء شد برغي التثبيت ، تأكد من أنه لا يمكن إزالته بسهولة عن طريق رفعه برفق لأعلى باستخدام الملقط. نظرا لأن زرع القسطرة نفسها يسبب صدمة في الأنسجة ، فإن إصابة الجافية الإضافية أثناء الحفر أو شد مسامير التثبيت ستؤدي إلى إصابات مؤلمة متعددة وربما تعيق قابلية المقارنة داخل المجموعة. شد مسامير التثبيت أولا وأدخل القسطرة أخيرا.
  8. أدخل القسطرة بطول 2 مم من خلال الفتحة الأولى ، عموديا على سطح الجمجمة. مع الاستمرار في حمل القسطرة ، ضع القليل من الأسمنت السني واتركه يتبلمر مع التعرض لفترة وجيزة (~ 5 ثوان) لضوء علاج الأسنان لتثبيت القسطرة ، مما يسمح باستخدام كلتا يديك في الخطوة التالية.
    أنذر: أثناء العمل باستخدام ضوء علاج الأسنان ، تجنب النظر مباشرة إلى الحافة ، أو إلى الضوء المنعكس من منطقة التطبيق ، لأن الكثافة العالية لهذا الضوء يمكن أن تسبب تلفا في الشبكية. استخدم نظارات واقية مناسبة.
  9. ضع المزيد من الأسمنت السني حول القسطرة ، وقم بتثبيت البراغي ، وقم بترسيخ الأسمنت السني بضوء علاج الأسنان (~ 15 - 30 ثانية). تأكد من تصلب الأسمنت بطرف الملقط.
< p class = "jove_title" >4. إغلاق الجرح واستعداء التخدير

  1. أغلق جلد الرأس بخيوط قابلة للامتصاص ، الأمامية والخلفية للقسطرة.
    ملاحظة: نظرا لأنه سيكون هناك إعداد وعر فوق الجمجمة في نهاية الزرع ، قم بإغلاق الجرح وفقا لذلك. سيؤدي رفع الجلد كثيرا إلى عدم الراحة للحيوان.
  2. حقن خليط الترياق تحت الجلد (1.5 مل/كغ من وزن الجسم) باستخدام حقنة سعة 1 مل بإبرة 26 جم.
  3. تطبيق الإنروفلوكساسين (2.5٪) بالحقن تحت الجلد (7.5 ملغ/كغ من وزن الجسم) للعلاج الوقائي بالمضادات الحيوية. تطبيق الكاربروفين (1 ملغم/مل؛ 5 ملغ/كغ من وزن الجسم) والبوبرينورفين (1.2 ملغ/كغ) لتخفيف الألم عن طريق الحقن تحت الجلد.
فئة < ص = "jove_title" >5. رعاية ما بعد الجراحة والأدوية

  1. أعد إلى القفص المعدل واحتفظ به تحت الملاحظة لمدة 1-3 ساعات ، مع تطبيق ضوء الأشعة تحت الحمراء لتجنب انخفاض حرارة الجسم. راقب باستمرار وأعد وضعه كل 5 إلى 10 دقائق حتى التعافي بعد الجراحة. توخي الحذر بشكل خاص لتجنب التعرض المستمر للضوء للعينين حتى الشفاء.
  2. كرر إدارات الإنروفلوكساسين (7.5 ملغ/كغ من وزن الجسم) والكاربروفين (1 ملغ/مل؛ 5 ملغ/كغ من وزن الجسم) عن طريق الحقن تحت الجلد في اليوم التالي للجراحة. البوبرينورفين ليس ضروريا ليتم تحديثه لأن العلاج السابق فعال لمدة 72 ساعة.
< p class = "jove_title" >6. تحضير خليط التحصين (على أقل تقدير بعد 14 يوما من زرع القسطرة)

ملاحظة: ضع المحاقن على الثلج أثناء إجراء التحضير.

  1. قم بتوصيل حقنتين زجاجيتين برأس قفل Luer سعة 10 مل بالأذرع القصيرة لمحبس ثلاثي الاتجاهات وأغلق المنفذ الثالث بالذراع الطويل.
  2. تأكد من أن التوصيلات آمنة وخالية من التسرب: أضف ما يقرب من 4 مل من PBS المعقم إلى المحقنة المفتوحة أثناء الإمساك بالمكبس 2. أدخل المكبس 1 وادفع كلا المكابس ذهابا وإيابا أثناء التحقق من وجود تسرب. في حالة عدم حدوث تسرب ، تخلص من PBS وقم بإزالة المكبس 1 مرة أخرى.
  3. ماصة 1 مل من مساعد فرويند غير المكتمل (IFA) و 50 ميكروغرام من البروتين السكري قليل التغصن المؤتلف من المايلين (rMOG1-125) معا وضبط الخليط على حجم نهائي قدره 2 مل مع PBS معقم (درجة الحموضة 7.4) في أنبوب مناسب. < / > ملاحظة: نظرا لفقدان المستحلب على أطراف أو جدران المحاقن أثناء التحضير ، قم بإعداد حجم أكبر مما هو مخصص للإدارة. وبالمثل ، من العملي التحضير لأكثر من واحد في وقت واحد.
  4. ضع خليط IFA و rMOG1-125 المخفف في المحقنة المفتوحة. أدخل المكبس برفق مع الحفاظ على ضغط فضفاض على المكبس المقابل (الشكل 3 أ).
  5. قم باستحلاب اللقاح عن طريق دفعه من حقنة إلى أخرى عن طريق دفع المكابس ذهابا وإيابا حتى يصبح أبيض ولزجا (الشكل 3 ب).
  6. قم بتثبيت حقنة قفل Luer سعة 1 مل على الذراع القصير المفتوح لمحبس ثلاثي الاتجاهات واملأه باللقاح (الشكل 3C). توزيع جميع اللقاح على 1 مل المحاقن. احتفظ بها على الثلج حتى الحقن. إدارة الخليط في يوم التحضير.
< p class = "jove_title" >7. التمنيع

  1. تخدير الفئران مع الأيزوفلوران في غرفة (~ 2 دقيقة ، ممزوجة بالأكسجين 2 لتر / دقيقة) ثم الحفاظ على التخدير من خلال قناع (ممزوج بالأكسجين 1.5 لتر / دقيقة).
  2. حقن 200 ميكرولتر من اللقاح تحت الجلد في قاعدة الذيل باستخدام إبرة 21 G.
    ملاحظة: قم بإعطاء الحقن ببطء لأن المحلول لزج.
فئة

8. حقن السيتوكين داخل المخ

  1. اضبط طول قنية الموصل (2 مم). (انظر الشكل 4 للحصول على خطوات التحضير.)
  2. املأ حقنة سعة 1 مل بخليط السيتوكين (500 نانوغرام / ميكرولتر من عامل نخر الورم ألفا (TNF-alpha) ، 300 وحدة / ميكرولتر من إنترفيرون جاما المؤتلف للفئران (IFN-gamma) في PBS المعقم). قم بتوصيل المحقنة بقنية الموصل. املأ القنية بخليط السيتوكين. تجنب أي فقاعات.
  3. قم بتركيب المحقنة على مضخة الحقنة القابلة للبرمجة وقم ببرمجتها لحقن 0.2 ميكرولتر / دقيقة (الشكل 5 أ). ابدأ تشغيل المضخة واستمر في عملها لتجنب تكوين فقاعة هواء عند طرف القنية. < / > ملاحظة: يجب أن تأخذ سرعة الحقن في الاعتبار القطر الداخلي للحقنة المحددة المستخدمة ؛ وبالتالي ، يجب تسجيل قطر المحقنة أثناء إعداد المضخة.
  4. قم بتخدير الجرذ بالأيزوفلوران في غرفة (~ 2 دقيقة ، ممزوجا ب 2 لتر / دقيقة من الأكسجين) ثم حافظ على التخدير من خلال قناع (ممزوج ب 1.5 لتر / دقيقة من الأكسجين) (الشكلان 5 ب و 5 ج). ضع قطرات العين المزلقة حيث سيتم تخدير لمدة 30 دقيقة على الأقل.
  5. قم بإزالة غطاء القسطرة مع المدخل. أدخل قنية الموصل في القسطرة وقم بتثبيتها وشدها (الشكلان 5D و 5E).
    ملاحظة: لا تفرط في إحكام ربطه ، لأن ذلك سيدمر الطرف العلوي للقسطرة.
  6. اترك الحقن يستمر لمدة 10 دقائق (الحجم الإجمالي للحقن 2 ميكرولتر). أوقف المضخة. اترك القنية داخل القسطرة لمدة 20 دقيقة للسماح للحجم المحقون بالانتشار بالكامل.
  7. قم بفك قنية الموصل وإزالتها ببطء لتجنب تأثير الفراغ.
  8. أعد توصيل غطاء القسطرة بالمدخل وقم بلفه. اسمح للحيوان بالتعافي من التخدير في قفص.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >figure-results-1
الشكل 1: تحضير القسطرة. (أ و ب) يتم تجميع قنية التوجيه والقنية الوهمية (غطاء القسطرة مع المدخل) وتثبيتها. (ج) ثم يتم قطع القسطرة إلى حجم 2 مم بمساعدة مشرط. أظهرت الملاحظة المجهرية أن استخدام المقص لهذا الغرض يشوه الشكل الدائري لطرف القنية ، وبالتالي يجب تجنبه.

< p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات ذكور الفئران الداكنة البالغة (300 ±25 جم) الفنتانيل Hameln pharma plus ، ألمانيا في صورة فنتانيل سترات ، 50 ميكروغرام / مل ميدازولام ERWO فارما ، النمسا 50039017 5 ملغ/مل ميديتوميدين أوريون فارما ، فنلندا في صورة هيدروكلوريد ميدتوميدين ، 1 مجم / مل فلومازنيل Roche, سويسرا 0.1 ملغ/مل أتيباميزول أوريون فارما ، فنلندا في صورة هيدروكلوريد أتيباميزول ، 5 مجم / مل مركب بوفيدون اليود 10٪ Mundipharma, النمسا الاسمنت للأسنان هيريوس كولزر ، ألمانيا 6603 7633 محلول ملحي فسيولوجي فريسينيوس كابي ، النمسا 0.9٪ كلوريد الصوديوم محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) سيجما ألدريتش ، ألمانيا ص 3813 الأيزوفلوران AbbVie ، النمسا قطرات العين المزلقة ثيا فارما ، النمسا 70٪ إيتوهيد ميرك ، ألمانيا 1070172511 تم تخفيف الإيثانول المطلق في ddH2O لتحضير 70٪ من الحجم/حجم 2.5٪ إنروفلوكساسين Bayer, ألمانيا المضادات الحيوية الوقائية كاربروفين فايزر، الولايات المتحدة الأمريكية مسكنات الألم، 50 ملغم/مل توين 20 سيجما ألدريتش ، ألمانيا ص 9416 بنتوباربيتال ريختر فارما ، النمسا الصوديوم البنتوباربيتال ، 400 مجم / مل إنترفيرون جاما PeproTech ، الولايات المتحدة الأمريكية 400-20 عامل نخر الورم ألفا أنظمة البحث والتطوير ، الولايات المتحدة الأمريكية 510-RT-050 / CF rMOG1-125 منتج خاص في مركز الطب الجزيئي ، معهد كارولينسكا ، السويد البروتين السكري قليل التغصن للفئران المؤتلف ، الأحماض الأمينية 1-125 من الطرف N ، متوفر تجاريا أيضا: AnaSpec ، AS-55152-500 ، الولايات المتحدة الأمريكية مساعد فرويند غير مكتمل سيجما ألدريتش ، ألمانيا F5506 ألبومين مصل الأبقار سيجما ألدريتش ، ألمانيا أ 9576 محلول الركيزة بيروكسيداز مختبرات ناقلات ، الولايات المتحدة الأمريكية سك 45000 إطار تجسيمي ديفيد كوبف إنسترومنتس، الولايات المتحدة الأمريكية القسطرة ، التصوير بالرنين المغناطيسي مناسب PlasticsOne ، الولايات المتحدة الأمريكية 8IC315GPKXXC قنيات وهمية PlasticsOne ، الولايات المتحدة الأمريكية 8IC315DCNSPC مسامير بلاستيكية ، التصوير بالرنين المغناطيسي مناسبة PlasticsOne ، الولايات المتحدة الأمريكية 8L080X093N01 قنية الموصل PlasticsOne ، الولايات المتحدة الأمريكية 8IC313CXSPCC مفك براغي بحجم طرف 2 مم حفر مع تمديد رمح مرن بروكسون ، ألمانيا رقم 28 472 ، رقم 28 706 ، رقم 28 620 ، مثقاب ، دائري ، 0.5 مم هاجر ومايسينجر ، ألمانيا المرجع 310 104 001 001 009 مثقاب ، ملتوي ، 1.3 مم هاجر ومايسينجر ، ألمانيا الرقم REF350 104 417 364 013 مشرط براون، ألمانيا BB510 مقبض مشرط أدوات العلوم الجميلة ، ألمانيا 91003-12 قضيب طرف القطن هنري شاين الطبية ، النمسا 900-3155 مقص جراحي أدوات العلوم الجميلة ، ألمانيا 14101-14 ، 14088-10 ملقط جراحي أدوات العلوم الجميلة ، ألمانيا 11002-12 ، 11251-35 مشابك البلدغ أدوات العلوم الجميلة ، ألمانيا 18050-35 بطانية متجانسة الحرارة أنظمة TSE ، ألمانيا مصباح الأشعة تحت الحمراء Beurer ، ألمانيا 616.51 دولار ضوء علاج الأسنان قويلين نقار الخشب الطبي ، الصين خياطة قابلة للامتصاص جونسون آند جونسون، بلجيكا V792E مضخة حقنة قابلة للبرمجة الأجهزة الدقيقة العالمية ، الولايات المتحدة الأمريكية ال 1000 قفازات الامتحان ثوب جراحي ماكينة حلاقة كهربائية Aesculap, ألمانيا جي تي 420 مبخر مخدر متطاير روثاخر الطبية ، سويسرا السيرة الذاتية 30-301-D مصدر الأكسجين لمبخر التخدير المتطاير اير ليكويد، النمسا 19,113 غرفة التخدير المتطايرة روثاخر الطبية ، سويسرا PS-0347 قناع التخدير للفئران روثاخر الطبية ، سويسرا PS-0307-A حقنة 1 مل كودان ، الدنمارك الرقم المرجعي 62.1612 26 إبرة قياس للحقن براون، ألمانيا 4657683 20 إبرة قياس لحقن السيتوكين والتحصين براون، ألمانيا 4657519 محاقن زجاجية ذات طرف قفل لور بولتن آند جراف ، ألمانيا 7.140-37 3 طريقة محبس بيكتون ديكنسون ، السويد 394600 حاضنة 37 درجة مئوية كندرو ، ألمانيا 50042301 الماصات الدقيقة جيلسون ، الولايات المتحدة الأمريكية F167350

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة