توليد نموذج جلدي جرح الأغنام خارج الجسم الحي مصاب بممرض بكتيري

الملخص

المصدر: Regan ، H. C. ، et al. نموذج جديد عالي الإنتاجية لجرح جلد الأغنام خارج الجسم الحي لاختبار المضادات الحيوية الناشئة. J. Vis. Exp. (2022).

يوضح الفيديو توليد نموذج لجلد الأغنام خارج الجسم الحي المصاب بالمكورات العنقودية الذهبية. يستلزم ذلك علاج قسم خزعة جلد جبهة الحمل بالمضادات الحيوية ، وإنشاء سرير الجرح ، ووضعه على غشاء قابل للاختراق في صفيحة متعددة الآبار بوسط خال من المضادات الحيوية ، وإنشاء عدوى بكتيرية في الجرح الجلدي.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< ص الفئة = "jove_title" >1. التعقيم

1. قم بتطهير الملقط قبل جمع الرؤوس عن طريق أخذ ملقط نظيف وإجراء التعقيم بالحرارة الجافة في فرن على حرارة 200 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
2. قم بتنفيذ جميع الأعمال الموصوفة داخل خزانة علم الأحياء الدقيقة من الفئة 2. قم بإعداد جميع الكواشف حسب تعليمات الشركة المصنعة.

< p class = "jove_title" >2. جمع العينات

1. في المسلخ ، تم ذبح حملان Swaledale عن طريق الصعق باستخدام الكهرباء أو مسدس الترباس الأسير وإخراجها. اجمع رؤوس الضأن لمدة لا تزيد عن 4 ساعات بعد الذبح.

< ص الفئة = "jove_title" >3. تحضير الرؤوس

1. قم بتطهير الجزء من جبهة الحمل عن طريق سكب ما يقرب من 100 مل من محلول ثاني أكسيد الكلور 200 جزء في المليون على منطقة العينة. احلق الجزء من الجبهة من الرأس باستخدام مقصات كهربائية واغسل المنطقة ب 200 مل من محلول ثاني أكسيد الكلور 200 جزء في المليون.
2. امسحي المنطقة بالإيثانول واللفافة الزرقاء وغطي منطقة العينة بكريم إزالة الشعر لمدة 35 دقيقة. اكشطي كريم إزالة الشعر برفق باستخدام أداة الكشط وقيمي منطقة العينة. إذا بقيت كمية كبيرة من الشعر ، كرر عملية إزالة الشعر.
3. استخدم 200 مل أخرى من محلول ثاني أكسيد الكلور لشطف المنطقة ، ثم اشطفها بالإيثانول وامسحها بلفافة زرقاء.
4. باستخدام لكمة خزعة معقمة مقاس 8 مم ، قم بقص عينات الجلد مقاس 8 مم من المنطقة المحضرة. قم بإزالة العينات باستخدام ملقط معقم ومشرط مكون من 15 شفرة ، مع ضمان إزالة جميع الدهون الجلدية.
5. ضع العينات في وعاء معقم سعة 0.5 لتر مملوء بمحلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS) ، ثم انقلها إلى أنابيب معقمة سعة 50 مل مع 50 مل من محلول ثاني أكسيد الكلور 200 جزء في المليون ، واقلبها مرتين ، واتركها للتعقيم لمدة 30 دقيقة.
6. قم بإزالة العينات من محلول ثاني أكسيد الكلور واغسلها عن طريق وضعها في أنبوب سعة 50 مل مملوء ب 40 مل من PBS المعقم. بمجرد غسلها ، ضع كل عينة من الجلد في بئر منفصل من طبق 24 بئرا.
7. أضف 350 ميكرولتر من الوسط الدافئ مسبقا مع الحفاظ على العينة في واجهة الهواء السائل. تكوين الوسائط على النحو التالي: وسائط MK (متوسط 199 مع أملاح هانكس ، L-glutamate ، و 1.75 مجم / مل بيكربونات الصوديوم) و Ham's F12 بنسبة 1: 1 ، مع مصل بقري الجنين المضاف (FBS ، 10٪ v / v) ، عامل نمو البشرة (EGF ، 10 نانوغرام / مل) ، الأنسولين (5 ميكروغرام / مل) ، البنسلين الستربتومايسين (100 وحدة / مل) ، والأمفوتريسين ب (2.5 ميكروغرام/مل).
8. أغلق الألواح المكونة من 24 بئرا بختم صفيحة نفاذة للغاز واحتضانها عند 37 درجة مئوية في حاضنة مناديل مرطبة بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة تصل إلى 24 ساعة.

فئة < ص = "jove_title" >4. صيانة عينات الجلد

1. بعد الحضانة ، قم بإزالة وسط الاستزراع وشطف العينات في 500 ميكرولتر من محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS). أضف وسائط خالية من المضادات الحيوية إلى كل عينة واحتضانها عند 37 درجة مئوية في حاضنة أنسجة مرطب بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون_لمدة 24 ساعة لإزالة المضادات الحيوية المتبقية في العينة.
2. إذا ظهرت تعكارة أو عدوى فطرية في الوسائط الخالية من المضادات الحيوية بعد 24 ساعة ، فتخلص من العينة.

< ص الفئة = "jove_title">5. تحضير اللقاح

1. قم بإعداد أنبوب سعة 50 مل مع 10 مل من مرق الصويا المعقم. خذ طبق أجار طازج من S. aureus واستخدم مسحة لنقل عدة مستعمرات إلى المرق. احتضن لمدة 18 ساعة عند 37 درجة مئوية عند 150 دورة في الدقيقة.
2. جهاز طرد مركزي عند 4,000 × جم لمدة 3 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق حبيبات الخلية في 10 مل من PBS المعقم. كرر مرتين لضمان الغسيل الكافي للخلايا.
3. اضبط اللقاح على 0.6 OD₆₀₀ في PBS المعقم. تأكد من حمل اللقاح عن طريق إجراء عدد يدوي للألواح القابلة للتطبيق.

< p class = "jove_title" >6. عدوى عينات الجلد

1. قم بإعداد طبق جديد من 24 بئرا مع 400 ميكرولتر من الوسائط الخالية من المضادات الحيوية الدافئة مسبقا وأضف الحشوات المكونة من 24 بئرا باستخدام ملقط معقم.
2. قم بإزالة الوسائط من عينات الجلد ، واغسلها ب 500 ميكرولتر من PBS المعقم ، ثم قم بإزالة الغسيل. استخدم ملقطا معقما لتثبيت العينة برفق في قاع البئر.
3. استخدم خزعة ثقب 4 مم لعمل رفرف جرح مركزي ، يخترق حتى عمق تقريبي من 1-2 مم. بعد ذلك ، استخدم مشرطا من 15 شفرة وملقط أنسجة أليس معقمة مسنن لإزالة الطبقة العليا من سديلة الجرح. قد يؤثر التباين في أبعاد الجرح على نتيجة العدوى ووحدات تشكيل مستعمرة النهاية (CFU).
4. بمجرد إصابة جميع العينات ، انقلها إلى إدخالات 24 بئرا باستخدام ملقط معقم. ماصة 15 ميكرولتر من اللقاح البكتيري في فراش الجرح. ثم احتضن لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة أنسجة مرطبة بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
5. إذا كانت فترات الحضانة الأطول ضرورية ، فقم بإزالة الوسائط واستبدلها بوسائط جديدة كل 24 ساعة واحتضانها في نفس الظروف.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 24 لوحة رفيق جيدة SLS 353504 4 مم خزعة لكمة ويليامز الطبية د7484 أنابيب الطرد المركزي 50 مل فيشر ساينتيك 10788561 8 مم خزعة لكمة ويليامز الطبية د7488 محلول الأمفوتريسين ب ، معقم سيغما أ 2942 ماكينة قص الشعر اللاسلكية كولور برو ستايل وال 9639-2117X ماكينة قص الشعر حاضنة فرن مزدوجة SLS ÖVe1020 فرن تعقيم عامل نمو البشرة SLS E5036-200UG ايثانول هانيويل 458600-2.5 لتر F12 لحم الخنزير سيغما ن4888 مصل الأبقار الجنينية Labtech الدولية CA-115/500 ملقط فيشر ساينتيك 15307805 كريم إزالة الشعر فيت لا ينطبق هيراسيل فيوس 160i الترمو: العلمية 15373212 حاضنة زراعة الأنسجة هيريوس ميجافوجي 16R VWR 521-2242 الطرد المركزي إدراج فردي 24 بئر 0.4um غشاء VWR الدولية 353095 الأنسولين ، المؤتلف البشري SLS 91077C-1G متوسطة 199 ([مك] إعلام) سيغما م 0393 صفيحة دقيقة ، ثقافة الخلية كوستار 96 جيدا فيشر ساينتيك 10687551 موليترون المعلومات لا ينطبق حاضنة بكتيرية أقراص PBS سيغما P4417-100TAB البنسلين - ستربتومايسين SLS P0781 أختام اللوحة فيشر ساينتيك ESI-B-100 آمن 2020 فيشر ساينتيك 1284804 خزانة سلامة علم الأحياء الدقيقة من الفئة الثانية شفرة المشرط رقم 15 فيشر ساينتيك [أو305] مشرط سوان مورتون فيشر ساينتيك 11849002 بيكربونات الصوديوم سيغما S5761-1 كجم ملقط أنسجة أليس المسنن روسيالي RSPU500-322 مرق الصويا Tryptic ميرك لايف ساينس المملكة المتحدة المحدودة 41298-500 جيم-فهرهايت أقراص فيموبا مختبرات Quip VMTAB75BX