تقنية لتحرير الجينات في الخلايا القاتلة الطبيعية باستخدام كريسبر كاس9

الملخص

المصدر: Naeimi Kararoudi، M.، et al. توليد الخلايا الطبيعية البشرية الأولية والموسعة بالضربة القاضية باستخدام البروتينات النووية الريبية Cas9. J. Vis. Exp. (2018).

يوضح هذا الفيديو تقنية للتعديل الجيني بوساطة البروتين النووي الريبي Cas9 للخلايا القاتلة الطبيعية الأولية (NK). يتم إدخال البروتين النووي الريبي Cas9 ، الذي يتكون من نوكلياز داخلي Cas9 المرتبط بدليل الحمض النووي الريبي (gRNA) الذي يتكون من إقران قاعدة CRISPR RNA (crRNA) و crRNA المنشط عبر (tracrRNA) ، في الخلايا القاتلة الطبيعية الأولية عن طريق التثقيب الكهربائي. يستهدف البروتين النووي الريبي ويشق الحمض النووي المضيف في الموقع المستهدف ، مما يؤدي إلى ضربة قاضية للجين عن طريق تعديل الجين المستهدف من خلال آلية الإصلاح الخلوي.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

فئة

1. تنقية الخلايا البشرية القاتلة الطبيعية وتوسيعها

1. عزل خلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMCs) من بافي كوت.
   1. طبقة 35 مل من عينة معطف بافي على 15 مل من Ficoll-Paque.
   2. جهاز طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 20 دقيقة بدون فرامل وجمع PBMC من الواجهة.
   3. اغسل PBMCs المستردة ثلاث مرات عن طريق إضافة حجم متساو على الأقل من PBS ، والطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق ، وشفط غسل PBC. يمكن عزل الخلايا القاتلة الطبيعية في هذه المرحلة بواسطة RosettesSep.
2. قم بتوسيع الخلايا القاتلة الطبيعية عن طريق التحفيز بخلايا التغذية التي تعبر عن 10 × 10⁶ ميجابايت IL21 المشععة في الأيام 0 و 7 و 14. استبدل الوسائط ب RPMI جديد يحتوي على 10٪ FBS و 1٪ جلوتامين و 1٪ بنسلين ستربتومايسين و 100 وحدة دولية / مل من IL-2 لحجم الوسائط بالكامل كل يومين.

< p class = "jove_title" >2. تصميم واختيار gRNA

1. اختر المواقع الجينومية المحددة لاستهدافها ، باستخدام الأدوات عبر الإنترنت ، على سبيل المثال ، NCBI ، Ensemble.
   مثل.< / > الوصف: تحويل مستقبلات بيتا لعامل النمو 2 (TGFBRR2) المجال الخارجي
   عرض السجل: PF08917
   عرض InterPro: IPR015013
   الموضع: 49 - 157 AA
   التسلسل المستهدف: Exon 4 من جين TGFBR2 (ENSG00000163513)
2. لتصميم gRNAs ، استخدم أدوات الويب لتصميم CRISPR مثل http://crispr.mit.edu و "Benchling".
   1. أدخل تسلسل الحمض النووي المختار في الخطوة 2.1. اختر الإنسان (الزئبق 19) كجينوم مستهدف. سيتم مسح أدلة كريسبر (20 نيوكليوتيد متبوعا بتسلسل الشكل المجاور للفاصل الأولي (PAM): NGG) من التسلسل الذي تم إدخاله سابقا. كما يظهر التطابقات المحتملة خارج الهدف في جميع أنحاء الجينوم المحدد.
   2. اختر أفضل ثلاثة gRNAs التي حصلت على أعلى الدرجات ، بناء على معدلاتها المستهدفة وغير المستهدفة. على سبيل المثال ، يوضح الجدول 1 الحمض النووي الريبي CRISPR المصمم لاستهداف exon 4 من جين TGFBR2 المقترح بواسطة أدوات تصميم CRISPR.
3. اطلب الحمض النووي الريبي CRISPR كcrRNAs خاصة بالتسلسل الاصطناعي.
4. اطلب الحمض النووي الريبي المحفوظ والمحول (tracrRNA) للتفاعل من خلال التماثل الجزئي مع crRNA.

< p class = "jove_title" >3. تصميم حذف الفحص الاشعال

1. تصميم بادئات تمتد عبر مواقع انقسام gRNA لمقايسة طفرة T7E1.
2. استخدم بادئات على بعد 100 نقطة أساس على الأقل من موقع الانقسام المتوقع لضمان ظهور حذف الإدراج الصغير (indels) في الموقع المستهدف sgRNA على هلام الاغاروز بنسبة 1.5٪ بعد مقايسة الطفرة. يوضح الجدول 2 البادئات التي تستخدم لتضخيم المجال الخارجي TGFBR2.

< p class = "jove_title" >4. نقل الخلايا الطبيعية الأولية والموسعة البشرية

ملاحظة: يتم نقل عناصر Cas9 / RNPs إلى NK عن طريق التثقيب الكهربائي باستخدام نظام 4D على النحو التالي.

1. تحضير الخلية
   1. بالنسبة لخلايا NK الأولية ، احتضان خلايا NK المعزولة حديثا في وسط معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) في وجود 100 وحدة دولية / مل من IL-2 لمدة 4 أيام وقم بإجراء التثقيب الكهربائي في اليوم 5. استبدل الوسائط كل يومين كما هو موضح سابقا وفي اليوم السابق للتحويل
   2. بالنسبة لخلايا القاتل الطبيعية الموسعة ، قم بتحفيز الخلايا في اليوم 0 بخلايا التغذية المشععة بنسبة 1: 1 وقم بإجراء التثقيب الكهربائي في اليوم 5 أو 6 أو 7. استبدل الوسائط كل يومين كما هو موضح سابقا وفي اليوم السابق للتحويل
   3. في يوم التثقيب الكهربائي ، قم بإعداد قارورة T25 مملوءة ب 8 مل من RPMI الطازج يحتوي على 100 وحدة دولية / مل من IL-2 للخلايا التي تخضع للتثقيب الكهربائي والحضانة المسبقة للقوارير في حاضنة رطبة 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
      ملاحظه: يمكن أن تكون الخلايا المذابة أو الخلايا التي خضعت للتحفيز الثاني أو الثالث كهربائية في أي وقت بعد تعافيها كما هو موضح.
   4. خذ 3-4 × 10⁶ خلايا لكل حالة ل 26 ميكرولتر من مزيج التنبيغ.
      ملاحظه: يعزز التركيز العالي جدا لخلايا القاتل الطبيعية في محلول التثقيب الكهربائي معدل التحويل.
   5. اغسل الخلايا 3 مرات باستخدام PBS لإزالة جميع FBS ، والتي تحتوي عادة على نشاط RNase. قم بتدويرها في كل مرة بمعدل 300 × جم لمدة 8 دقائق.
      ملاحظه: ضع في اعتبارك 7 شروط للتثقيب الكهربائي ل Cas / RNPs مثل gRNA واحد (gRNA1 ، gRNA2 ، gRNA3) ومزيج من اثنين من gRNAs (gRNA1 + gRNA2 ، gRNA1 + gRNA3 ، gRNA2 + gRNA3) وعنصر تحكم واحد بدون Cas9 / RNPs.
2. شكل crRNA: tracerRNA / مركب
   1. أعد تعليق crRNAs (gRNA1 و gRNA2 و gRNA3) و tracerRNA في محلول 1x TE إلى التركيزات النهائية البالغة 200 ميكرومتر. امزج 2.2 ميكرولتر من كل 200 ميكرومتر gRNA مع 200 ميكرومتر tracerRNA كما هو موضح في الجدول 3.
   2. سخني العينات على حرارة 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق واتركيها لتبرد على سطح المقعد إلى درجة حرارة الغرفة (15-25 درجة مئوية). قم بتخزين الحمض النووي الريبي المعلق و crRNA: tracrRNA / مركب عند -20 درجة مئوية لاستخدامه لاحقا.
3. شكل مركب RNP
   ملاحظة: لتوفير الوقت ، قم بتشكيل مركب RNP أثناء خطوة الغسيل 4.1.5.
   1. بالنسبة لتفاعل crRNA: tracrRNA المزدوج ، قم بتخفيف نوكلياز Cas9 إلى 36 ميكرومتر كما هو موضح في المثال في الجدول 4.
   2. للنقل المركب ل crRNA: tracrRNA على الوجهين ، قم بتخفيف نوكلياز Cas9 إلى 36 ميكرومتر كما هو موضح في المثال في الجدول 5.
   3. أضف نوكلياز Cas9 إلى الازدواج crRNA: tracrRNA ببطء أثناء تدوير طرف الماصة ، أكثر من 30 ثانية إلى 1 دقيقة.
   4. احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 15-20 دقيقة. إذا لم تكن جاهزا لاستخدام الخليط بعد الحضانة ، احتفظي بالخليط على الثلج حتى الاستخدام.
4. التثقيب الكهربائي
   1. أضف المكمل بالكامل إلى محلول التثقيب الكهربائي P3 واحتفظ به في درجة حرارة الغرفة.
   2. أعد تعليق حبيبات الخلية (3-4 × 10⁶ خلايا من الخطوة 4.1.5) في 20 ميكرولتر من محلول التثقيب الكهربائي الأساسي P3 4D. تجنب فقاعات الهواء أثناء سحب العينات.
      ملاحظة: لا ينبغي ترك الخلايا لفترة طويلة في محلول P3.
   3. أضف على الفور 5 ميكرولتر من مركب RNP (الخطوة 4.3) إلى تعليق الخلية.
   4. أضف 1 ميكرولتر من محسن التثقيب الكهربائي Cas9 100 ميكرومتر إلى مزيج Cas9 / RNPs / الخلية.
   5. انقل مزيج Cas9 / RNPs / الخلية إلى شرائط التثقيب الكهربائي سعة 20 ميكرولتر.
   6. اضغط برفق على الشرائط للتأكد من أن العينة تغطي الجزء السفلي من الشرائط.
   7. ابدأ نظام التثقيب الكهربائي 4D واختر برنامج EN-138.

< p class = "jove_content" > الجدول 1. ثلاثة gRNAs مصممة لاستهداف exon 4 من TGFBR2 ectodomain باعتباره crRNA اصطناعي.

رقم الحمض النووي الريبي (gRNA). تسلسل الحمض النووي الريبي مرتبة على أنها crRNA الاصطناعية الحمض النووي الريبي 1 5 CCCCTACCATGACTTATTC 3 /AltR1/rArGrUrCrArGrGrUrArGrArCrUrUrGrUrArGrCrUrArGrGrCrUrArArUrGrCrU/AltR2/ الحمض النووي الريبوزي النووي الريبوزي 2 5 ATTGCACTCATCAGAGCTAC 3 /AltR1/rArUrUrGrCrArCrUrArArUrArGrArCrArCrCrGrUrArGrArGrCrUrArGrGrUrArGrCrUrUr الحمض النووي الريبي 3 5 AGTCATGGTAGGGGAGCTTG 3 /AltR1/rArG rUrCrA rUrGrG rUrArGrGrG rArGrC rUrUrG rGrUrA rGrArG rCrUrA rUrGrCrU/AltR2/ < p class = "jove_content" > الجدول 2. البادئات المستخدمة لتضخيم جين المجال الخارجي TGFBR2

TGFBR 2 بادئات المجال الخارجي FWD 5 GTC TGC TCC AGG TGA TGT TTA T3 TGFBR2 المجال الخارجي التمهيدي REV 5 جيجابايت CCT GAG AAT CTG CAT TTA 3

الجدول 3. قم بتشكيل crRNA: tracrRNA / مركب باستخدام 200 ميكرومتر RNAs

مكون المبلغ (uL) 200 ميكرومتر crRNA 2.2 200 ميكرومتر تتبع الحمض النووي الريبي 2.2 المخزن المؤقت IDTE 5.6 المنتج النهائي 10 < p class = "jove_content" > الجدول 4. بالنسبة لتفاعل crRNA المزدوج الفردي: tracrRNA ، قم بتخفيف نوكلياز Cas9 إلى 36 ميكرومتر.

مكون الكمية (ميكرولتر) برنامج تلفزيوني 1 crRNA: tracrRNA على الوجهين (من الخطوة 4.2) 2 (200 بمول) نوكلياز داخلي Alt-R Cas9 (مخزون 61 ميكرومتر) 2 الحجم الإجمالي 5 ميكرولتر

الجدول 5. للنقل المركب ل crRNA: تعمل الإرسال المزدوج tracrRNA على تخفيف نوكلياز Cas9 إلى 36 ميكرومتر.

مكون الكمية (ميكرولتر) برنامج تلفزيوني 1 crRNA: tracrRNA مزدوج (على سبيل المثال gRNA1) 1 (100 بمول) crRNA: tracrRNA مزدوج (على سبيل المثال gRNA2) 1 (100 بمول) نوكلياز داخلي Alt-R Cas9 2 الحجم الإجمالي 5 ميكرولتر

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات كوكتيل تخصيب الخلايا البشرية RosetteSep™ تقنيات STEMCELL 15065 م تم تصميم كوكتيل تخصيب الخلايا الطبيعية البشرية RosetteSep™ لعزل الخلايا القاتلة الطبيعية عن الدم الكامل عن طريق الانتقاء السلبي. فيكول باك® بلس جنرال إلكتريك للرعاية الصحية - علوم الحياة 17-1440-02 Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA تقنيات الحمض النووي المتكاملة 1072532 TracrRNA الذي يحتوي على تعديلات كيميائية خاصة تمنح مقاومة متزايدة للنوكلياز. يهجن إلى crRNA لتنشيط إنزيم Cas9 Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA تقنيات الحمض النووي المتكاملة يتم إنتاجه صناعيا باسم Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA ، بناء على تسلسل gRNA المصمم الذي يستهدف جين الاهتمام. طقم الكشف عن تحرير الجينوم Alt-R® تقنيات الحمض النووي المتكاملة 1075931 تحتوي كل مجموعة على نوكلياز داخلي T7EI ، ومخزن تفاعل T7EI ، وعناصر تحكم فحص T7EI. البلاتين® Taq DNA Polymerase عالية الدقة إنفيتروجين 11304-011 نظام 4D-Nucleofector™ لونزا AAF-1002B بروتين IL-2 المؤتلف البشري نوفارتيس هاتف: 65483-0116-07 P3 خلية أولية 4D-Nucleofector™ X Kit لونزا V4XP-3032 يحتوي على ناقل pmaxGFP™ ، محلول Nucleofector™ ، مكمل غذائي ، شرائط Nucleocuvette™ مكونة من 16 بئر عدم الاستهداف: siRNA مخصص ، قياسي 0.05 2 مول ON-TARGETplus دارماكون سي تي إم-360019 Alt-R® S.p. Cas9 Nuclease 3NLS تقنيات الحمض النووي المتكاملة 1074181 Cas9 Nuclease كتيب DNeasy® للدم والأنسجة كياجين 69504 مجموعة RNeasy الصغيرة كياجين 74104 كالسين AM ثيرموفيشر سي 3099 TGFβ بيوليجند 580706 طقم التحكم Alt-R® CRISPR-Cas9 ، بشري تقنيات الحمض النووي المتكاملة 1072554 يتضمن tracrRNA ، والتحكم الإيجابي HPRT crRNA ، والتحكم السلبي crRNA # 1 ، و HPRT Primer Mix ، و Nuclease-Free Duplex Buffer. IDTE درجة الحموضة 7.5 (1X TE Solution) تقنيات الحمض النووي المتكاملة 11-01-02-02 محسن التثقيب الكهربائي Alt-R® Cas9 تقنيات الحمض النووي المتكاملة 1075915 محسن التثقيب الكهربائي Cas9