$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. توليد لقاحات الأنفلونزا الحية الموهنة المؤتلفة عن طريق علم الوراثة العكسي
ملاحظة: تم وصف البروتوكول التفصيلي لتوليد فيروسات الأنفلونزا المؤتلفة عن طريق علم الوراثة العكسي في الدراسات السابقة وهو خارج نطاق هذا التقرير. باختصار ، يتم إنقاذ لقاحات الأنفلونزا المتكيفة مع البرد (CAV) في خزانة السلامة الأحيائية من الفئة الثانية تحت احتواء السلامة البيولوجية من المستوى 2 (BSL2) ، ويتضمن خطوات مفصلة أدناه.
- توليد لقاح الإنفلونزا المعاد تشكيله المتكيف مع البرد باستخدام السلالة A / Ann Arbor / 6/60 (H2N2) المتكيفة مع البرد ، بالإضافة إلى الهيماجلوتينين (HA) والنورامينيداز المعدل (NA) من سلالة A / PR / 8/34 (H1N1) (الشكل 1 أ). يتكون التعديل في جين NA من استبدال قائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل لتسلسل محفوظ في ساق البروتين (المخلفات من 65 إلى 72) بتسلسل (كدنا) قصير يشفر الببتيد المشتق من بويض الدجاج (OVA) SIINFEKL (الشكل 1 ب). الببتيد SIINFEKL هو ببتيد شديد المناعة في سياق الاستجابة المقيدة H-2b MHC من الفئة الأولى للفئران C57BL / 6.
- اللوحة 106 خلايا 293T لكل بئر في ألواح مكونة من 6 آبار باستخدام مصل بقري جنيني DMEM 10٪ (FBS) مكمل ب 1٪ بنسلين / ستربتومايسين (P / E).
- تحضير خليط تعداء البلازميد: أضف 1 ميكروغرام من كل واحد من البلازميدات التي تشفر cDNAs ل PB2 و PB1 و PA و NP و M و NS من سلالة الأنفلونزا A / Ann Arbor / 6/60 و 1 ميكروغرام من البلازميدات المشفرة ل NA-SIINFEKL و HA من الأنفلونزا A / PR / 8/34. أضف Opti الدافئ مسبقا - الحد الأدنى من الوسط الأساسي (Opti-MEM) (15 ميكرولتر لحجم نهائي يبلغ 100 ميكرولتر / بئر).
- احتضان مزيج التعداء لمدة 30 دقيقة في RT.
- أضف 100 ميكرولتر من مزيج / بئر واحتضان لمدة 16 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
- قم بتغيير وسائط الخلية بواسطة DMEM 0.3٪ BSA 1٪ P / E عند 33 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 5 ساعات.
- أضف 106 خلايا من خلايا الكلى المتساهلة بالإنفلونزا في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) تحتوي على 1 ميكروغرام / مل من التربسين من البنكرياس البقري المعالج ب L-1-Tosylamide-2-phenylethyl chloromethyl ketone (TPCK-trypsin). حافظ على المزارع المشتركة 293T-MDCK لمدة 2-3 أيام عند 33 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
- اجمع المواد الطافية للمزارع المشتركة لخلايا MDCK-293T وقم بمسحها بالطرد المركزي عند 260 × جم لمدة 5 دقائق.
