نموذج الزراعة المشتركة ثلاثية الأبعاد للخلايا التائية المتسللة في الورم الكروي

الملخص

المصدر: Lin, Y., et al. مراقبة غزو الخلايا السرطانية والسمية الخلوية للخلايا التائية في ثقافة 3D. J. Vis. Exp. (2020).

يوضح هذا الفيديو طريقة لإنشاء ثقافة كروية ثلاثية الأبعاد للورم والخلايا التائية. يتم تحضير قالب الاغاروز مع الآبار الصغيرة التي تحتوي على كرويات الورم ، تليها إضافة الخلايا التائية. بعد الحضانة ، يسمح هذا الإعداد بدراسة تفاعل الخلايا التائية مع الكرويات السرطانية في بيئة ثلاثية الأبعاد خاضعة للرقابة.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. توليد الكرويات

1. تحضير وتعقيم 2٪ agarose في 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) (على سبيل المثال ، 1 جم agarose في 50 مل من 1x PBS) والأوتوكلاف 35 و 81 قوالب مطاطية ><ميكروويل. أنذر: تجنب استخدام الاغاروز منخفض الذوبان لتوليد قوالب الاغاروز لمعالجة الكيمياء المناعية (IHC).
2. تحضير قوالب الاغاروز
   ملاحظة: تستخدم قوالب 35 ميكروويل في فحوصات الغزو والتألق المناعي (IF) وعزل الخلايا. تستخدم قوالب 81-microwell لفحوصات السمية الخلوية ، و IHC ، وعزل الخلايا ، واستخراج الحمض النووي الريبي (RNA).
   1. بعد تعقيم الاغاروز ، اترك الاغاروز المنصهر يبرد إلى حوالي 60-70 درجة مئوية. في غطاء زراعة الخلايا ، استخدم تقنية معقمة وماصة 500 ميكرولتر من الاغاروز المنصهر في قالب مطاطي 81 ميكروويل لكل بئر أو 330 ميكرولتر في قالب مطاطي 35 ميكروويل لكل بئر.
      أنذر: تجنب تكوين فقاعات أثناء خلط أو سحب اللاغاروس. قم بإزالة أي فقاعات عن طريق سحب العينة برفق.
   2. بعد ترسيخ الاغاروز ، قم بثني القالب المطاطي بعناية لإزالة قالب الاغاروز منه. بموجب هذا ، ضع يديك فوق لوحة البئر المناسبة واترك قالب الاغاروز يسقط مباشرة في بئر واحد من لوحة البئر.
      ملاحظه: ثني القالب المطاطي في مواضع مختلفة لتجنب الثني الزائد. قد يكون من المفيد ثني القالب المطاطي والدفع برفق من الأسفل في نفس الوقت.
   3. لموازنة قوالب الاغاروز ، أضف وسط زراعة الخلايا ، الذي يتكون من Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) مكملا بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (2.5 مل / بئر لصفيحة 12 بئرا و 1 مل / بئر للوحة 24 بئرا). ضع صفيحة البئر في حاضنة زراعة الخلايا (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}) واحتضنها لمدة 1 ساعة.
3. في غضون ذلك ، قم بإعداد زراعة الخلايا للبذر.
   ملاحظه: يجب أن يقرر المحقق إجمالي عدد بذر الخلية لكل قالب agarose. بالنسبة لخطوط خلايا سرطان البنكرياس الأولية في الفئران ، يتم زرع 35,000 خلية / 35-microwell يلقي و 81,000 خلية / 81-microwell (في المتوسط 1000 خلية / كروية) لجميع المقايسات التالية. يبلغ متوسط قطر الكروي حوالي 150-200 ميكرومتر بعد 48 ساعة.
4. قم بإزالة وسط زراعة الخلايا المحيط بقالب الاغاروز باستخدام ماصة P1000 أولا عن طريق إمالة لوحة البئر. ثم قم بإزالة الوسط بعناية في غرفة البذر.
5. قم بزرع معلق الخلايا السرطانية المحضر بعناية في غرفة بذر الخلايا. ضع لوحة البئر بعناية مرة أخرى في حاضنة زراعة الخلايا (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}) لمدة 15 دقيقة < / > ملاحظه: خلال هذه الخطوة ، ستستقر الخلايا في الآبار الصغيرة لقالب الاغاروز.
6. أضف وسيطا إضافيا إلى الخارج من قالب الاغاروز (2.5 مل / بئر للوحة 12 بئرا و 1 مل / بئر للوحة 24 بئرا).
7. ضع لوحة البئر مرة أخرى في حاضنة زراعة الخلايا (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}) لمدة 48 ساعة < / > ملاحظه: عادة ما يستغرق الأمر ما يصل إلى بضع ساعات حتى تشكل الخلايا كروية في الآبار الصغيرة. بشكل عام ، تتشكل كرويات الخلايا السرطانية الصلبة بعد 24 ساعة وتكون مستقرة بعد 48 ساعة. ومع ذلك ، يمكن أن يختلف هذا بين خطوط الخلايا المختلفة. إذا لزم الأمر ، قم بتغيير وسط زراعة الخلايا عن طريق إمالة صفيحة البئر بعناية باستخدام قوالب الاغاروز وإزالة وسط زراعة الخلايا المحيط بماصة P1000. ثم أضف بعناية وسيطا جديدا عن طريق ماصته على طول جدار البئر. عادة ليس من الضروري تغيير الوسائط داخل القوالب نظرا لصغر حجمها وخطر إزالة الكرويات.

< p class = "jove_title" >2. الزراعة المشتركة مع الخلايا التائية

1. يعلق العدد المطلوب من الخلايا التائية في 75 ميكرولتر (35 ميكروويل مصبوب) أو في 190 ميكرولتر (81 ميكروويل مصبوبة) من وسط زراعة الخلايا التائية المناسب (RPMI مكمل بنسبة 10٪ مصل بقري جنيني و 100 وحدة / مل بنسلين / ستربتومايسين).
2. قم بإزالة وسط زراعة الخلايا المحيط بقالب الاغاروز باستخدام ماصة P1000 أولا عن طريق إمالة لوحة البئر. ثم قم بإزالة الوسط داخل الجبيرة ببطء وحذر عن طريق استهداف أحد أركان حجرة البذر برفق باستخدام ماصة P200 مع الحفاظ على إمالة الصفيحة جيدا باليد الأخرى.
3. (الخطوة الحرجة 1) نظرا لوجود خطر إزالة الكرويات ، تحكم في فقدان الكرات من خلال مقارنة عدد الكرات داخل الآبار الصغيرة قبل وبعد إزالة الوسط عن طريق المشاهدة تحت المجهر بتكبير 10 أضعاف.
4. قم بزرع معلق الخلية التائية بعناية في غرفة البذر في قالب الاغاروز عن طريق إمساك الماصة P200 بحوالي 0.5 سم فوق الجبيرة.
5. (الخطوة الحرجة 2) هناك خطر طرد الكرويات أثناء إضافة الخلايا التائية. لذلك ، من الأهمية بمكان إضافة الخلايا التائية ببطء شديد وحوالي 0.5 سم فوق غرفة البذر.
   ملاحظه: يتمثل أحد الاحتمالات لتقليل عدد الكرويات التي تم التخلص منها في توجيه الماصة إلى أحد أركان حجرة البذر أثناء إضافة الخلايا التائية ، وبالتالي المخاطرة فقط بالتخلص من الكرويات الموجودة في هذه الزاوية.
6. ضع لوحة البئر بحذر مرة أخرى في حاضنة زراعة الخلايا (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}) لمدة 15 دقيقة.
7. أخرج صفيحة البئر من الحاضنة وأضف وسط زراعة الخلايا الطازجة (وسائط معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) مكملة بمصل بقري للجنين بنسبة 10٪ و 100 وحدة / مل من البنسلين / الستربتومايسين) حول الأغروز المصبوب عن طريق ماصته ببطء على طول جدار البئر.
8. ضع لوحة البئر مرة أخرى في حاضنة زراعة الخلايا لمدة 48 ساعة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات أطباق بتري ثلاثية الأبعاد شركة الأنسجة الدقيقة Z764019 و Z764051 يشار إليها باسم "قوالب المطاط" في البروتوكولات ؛ قوالب 81-microwell و 35-microwell 8-شرائح غرفة الآبار لاب تيك 154534 Agarose Type I ، انخفاض تكافؤ فرص العمل سيجما ألدريتش أ 6013 DMEM، مصل الأبقار الجنينية ثيرموفيشر 11965092 ، 16000044 يشار إليها باسم "وسيط زراعة الخلايا" في البروتوكولات RPMI ثيرموفيشر 11875093 لوسط زراعة الخلايا التائية