تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
< p class = "jove_title" >
1. إجراء Acufection
ملاحظة: قد تختلف الكمية المثلى من الحمض النووي ومنطقة سطح الجلد المستهدف باختلاف الجينات وتحتاج إلى مزيد من التحسين. قد تختلف قوة الوخز وعدد المرات التي يتم فيها إرخاء الطبقة القرنية من الجلد أيضا اعتمادا على سمك الجلد. يجب تحديد هذه الشروط بعناية بعد تقييم مستوى التعبير عن نصوص الجينات الحانة بواسطة qRT-PCR.
- قم بوزن الفئران وإعطاء ثلاثي البروم الإيثانول (400 ميكروغرام لكل غرام من وزن الجسم) عن طريق الحقن البريتوني.
ملاحظة: 2،2،2-ثلاثي بروموإيثانول هو عامل مخدر عن طريق الحقن كان شائعا في الفئران. يتم تصنيع المحاليل عن طريق إذابة 2،2،2-ثلاثي بروموإيثانول من الدرجة غير الصيدلانية (2.5 جم) في الماء المقطر (200 مل) يحتوي على 2.5٪ من 2-ميثيل-2-بيوتانول.
- استخدم مرهم العيون البيطري على العينين لمنع الجفاف تحت التخدير.
ملاحظه: سيتم إحداث تأثير التخدير في 1-2 دقيقة. تحقق من منعكس قرصة إصبع القدم لضمان عمق كاف للتخدير قبل العملية.
- احلق جلد الخاصرة الظهرية وضعي كريم إزالة الشعر لإذابة بروتينات الكيراتين في جذع الشعر.
ملاحظه: استخدام كريم إزالة الشعر لإزالة الشعر سيسهل ضخ الحمض النووي في الجلد.
- استخدم كرات قطنية مبللة بالماء لمسح كريم إزالة الشعر.
ملاحظه: كريم إزالة الشعر قابل للذوبان في الماء. ستمنع الإزالة الكاملة للكريم السطح الدهني وتضمن نتيجة وخز أفضل.
- استخدم قطعة قطن معقمة مبللة ب 70٪ إيثانول لتطهير سطح الجلد.
- ضع علامة على المنطقة المستهدفة (1 سم × 1 سم) على الجلد منزوع الشعر باستخدام استنسل مقاس مسبقا. ملاحظه: سيساعد تحديد الموقع المستهدف في تطبيق حزمة الإبرة لأعلى ولأسفل داخل منطقة محددة. هذا مهم لضمان توصيل نفس الكمية من الحمض النووي إلى مساحة سطح معينة لتقليل التباين من تجربة إلى أخرى.
- ضع قطرة 10 ميكرولتر من الحمض النووي البلازميد (10 ميكروجرام) على الجلد المحدد.
ملاحظه: تختلف كمية الحمض النووي للعناد باختلاف الجينات ونوع ناقل التعبير. يجب معايرة كمية الحمض النووي المستخدمة بعناية قبل إجراء التجربة ذات الاهتمام. 10 ميكرولتر عبارة عن قطرة سائلة صغيرة وتجلس جيدا على الجلد المحلوق ومنزوع الشعر دون أن تتدحرج أثناء الوخز. قم بتضمين مجموعة تحكم من الفئران المعالجة ب 10 ميكرولتر من الحمض النووي الناقل الفارغ للمقارنة مع الفئران الحاصلة على جين الدراسة.
- امسك حزمة إبرة الوخز بالإبر (الشكل 1 ب) وخز السطح المحدد بحركة لأعلى ولأسفل لمدة 100 مرة أو حتى تختفي الرطوبة من الحمض النووي في PBS على الجلد. ملاحظه: قد يحدث بعض الاحمرار في سطح الجلد. تجنب إجراء جروح عميقة تنزف.
يتم تحديد عدد حركات الوخز لأعلى ولأسفل على سطح الجلد بشكل عملي عندما تختفي الرطوبة من الحمض النووي في PBS (10 ميكرولتر) على الجلد. قررنا 100 مرة في 30 ثانية لأنها أعطت النتائج الأكثر اتساقا من الجينات التي يتم تسليمها عن طريق العناق. إذا كان ذلك ممكنا ، يمكن إعادة استخدام الإبر لما يصل إلى 6 وخز جلدي مستهدف (1 سم × 1 سم لكل منهما). شطف الإبر في 70٪ الإيثانول و PBS بين الحد. قم بالتغيير إلى إبر جديدة عندما تكون باهتة أو للحمض النووي البلازميد المختلف لتجنب التلوث المتبادل.
- ضع الفئران المكسورة على وسادة تدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم حتى الاستيقاظ.
- أعد الفئران إلى قفصها عندما تستعيد وعيها الكافي. ملاحظه: احتفظ بالفئران الملطخة في قفص منفصل (أقل من 5 لكل قفص) من قفص الفئران غير المسكنة.
- ضع زجاجة الماء في مكانها وأعد القفص إلى رف IVC (قفص جيد التهوية بشكل فردي).
2. رعاية ما بعد الجراحة
- خلال أول 48 ساعة بعد الإجراء ، راقب الفئران عن كثب بحثا عن أي إزعاج بما في ذلك التغيرات السلوكية (الأرق أو الهياج أو اضطراب الأكل) أو المظهر غير الطبيعي (معطف الشعر الخشن أو الوضعية المنحنية).
