اختبار في المختبر لتقييم النشاط المضاد للورم للخلايا التائية ذات المستضدات المستضدة للورم

الملخص

المصدر: Kueberuwa, G., et al. نموذج لمفومة الخلايا البائية المتجانسة للفأر للتقييم قبل السريري للخلايا التائية CD19 CAR. J. Vis. Exp. (2018).

يوضح هذا الفيديو فحصا في المختبر للتحقق من صحة نشاط الخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري (CAR). يتم زراعة خلايا سرطان الغدد الليمفاوية للخلايا البائية التي تعبر عن مستضد CD19 ولوسيفيراز السيتوبلازمي مع خلايا CAR T الخاصة ب CD19. يحفز ارتباط CAR ب CD19 على الورم الخلايا التائية CAR على إطلاق السيتوكينات والسموم التي تسبب السمية الخلوية للخلايا السرطانية. يتم تقييم نشاط الخلايا التائية CAR عن طريق تحديد السيتوكين المنبعث وتقليل التلألؤ البيولوجي بوساطة لوسيفيراز في الخلايا السرطانية.

البروتوكول

1. التحقق من صحة نشاط الخلايا التائية CAR في المختبر

الخلايا
1. السرطانية المستهدفة للبذور CD19 + مع أو بدون تعبير لوسيفيراز بكثافة 1 × 10⁴ خلايا في 100 ميكرولتر وسط خلية تائية كاملة (TCM) / بئر في لوحة زراعة الأنسجة ذات القاع U 96 بئر.
2. أضف 1 × 10⁴ خلايا CD19 CAR T / بئر بحجم 100 ميكرولتر / بئر لتحقيق نسبة مستجيب إلى الهدف (E: T) تبلغ 1: 1.
   ملاحظه: يجب تحديد نسب E: T لكل بناء CAR وخط خلية مستهدف.
3. استخدم الخلايا التائية وحدها والخلايا السرطانية وحدها كعناصر تحكم سلبية والخلايا التائية المحفزة بواسطة فوربول ميريستات أسيتات (PMA) (50 نانوغرام / مل) والأيونوميسين (1 ميكروغرام / مل) كتحكم إيجابي لإطلاق إنترفيرون جاما (IFNγ). الخلايا المشتركة في الزراعة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 16-24 ساعة.
4. بعد الزراعة المشتركة ، قم بالطرد المركزي للألواح عند 500 × جم لمدة 5 دقائق واجمع المادة الطافية لمزيد من تحليل IFNγ و IL-12p70 ELISA.
   ملاحظه: يمكن تخزين هذا عند -80 درجة مئوية.
5. أعد تعليق كريات الخلايا في 100 ميكرولتر من PBS المحتوية على اللوسيفيرين (التركيز النهائي 1.5 مجم / مل). احتضان الألواح لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. ثم قم بقياس اللمعان من كل بئر باستخدام مقياس إضاءة مناسب.
   ملاحظه: يجب تحسين أوقات التعرض لخطوط الخلايا وكثافتها. النتائج التمثيلية موضحة في الشكل 1 أ. يمكن تعديل السمية الخلوية خارج الجسم الحي لخلايا CAR T للتعبير عن اللوسيفيرين عن طريق الزراعة المشتركة مع خطوط الخلايا التي تعبر عن المستضد المستهدف. نظرا لأن الخلايا التائية CAR تقتل الخلايا المستهدفة ، يتم إطلاق اللوسيفيرين ، وبالتالي يرتبط انخفاض إشارة قياس اللوئىنات بقتل الخلية. يمكن أن يكون للخلايا غير المنقولة في كثير من الأحيان تأثير على صلاحية الخلية المستهدفة ، خاصة خلال فترات الحضانة الطويلة. قم بقياس تركيز الفئران IFNγ و IL-12p70 في المادة الطافية وفقا لبروتوكولات ELISA الخاصة بالشركة المصنعة. تظهر النتائج التمثيلية في (الشكل 1 ب و 1 ج). يمكن فحص التنشيط خارج الجسم الحي لخلايا CAR T عن طريق الزراعة المشتركة مع خطوط الخلايا التي تعبر عن المستضد المستهدف عن طريق تحليل محتويات الطاف باستخدام ELISA. يجب تحسين نسبة الخلية التائية CAR إلى الخلايا المستهدفة وطول فترة الزراعة المشتركة لكل بنية CAR وخط الخلية المستهدف والتحليل يمكن استخدام علاج PMA و ionomycin كعنصر تحكم إيجابي لتأكيد جودة الخلايا التائية وقدرتها على الاستجابة.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1. التحقق من نشاط الخلايا التائية CAR. تم زراعة الخلايا التائية αmCD19 CAR مع خلايا سرطان الغدد الليمفاوية A20 المعدلة للتعبير عن لوسيفيراز (1 × 10⁴: 1 × 10 4: 1 × 10⁴) لمدة 16 ساعة في صفيحة U-bottom 96 بئر. بعد الزراعة المشتركة ، تم تكوير الخلايا ، وتم جمع المواد الطافية. أ) أعيد تعليق الخلايا في PBS وتم استخدام قياس اللومينومتر لتقييم جدوى الخ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 100X البنسلين والستربتومايسين والجلوتامين (PSG) جيبكو 10378016 مقياس التدفق الخلوي - LSR Fortessa x20 BD Biosciences 658222R1 مصل الأبقار الجنيني جيبكو 10270 IL-12 p70 ماوس غير مطلي ELISA Kit إنفيتروجين 88-7121-76 ملح الكالسيوم الأيونوميسين سيجما- ألدريتش أ 0634 مقياس الإضاءة - Lumistart Omega بي إم جي لابتك 415-301 طقم الفأر IFN-γ ELISA دياكلون 861.050.010 فوربول 12-ميريستات 13-أسيتات (PMA) سيجما- ألدريتش ص 8139 RPMI 1640 متوسط لونزا BE12-167F زينولايت دي لوسيفيرين بيركين إلمر 122799