اختبار في المختبر لتقييم السمية الخلوية للخلايا القاتلة الطبيعية ضد الخلايا السرطانية

الملخص

المصدر: Baik ، C. H. ، et al. اختبار السمية الخلوية القائم على اللوحة لتقييم وظيفة التحلل الخلوي الطبيعي للخلية القاتلة المشيمية للفئران. J. Vis. Exp. (2019)

يوضح هذا الفيديو إجراء اختبار إطلاق نازعة هيدروجين اللاكتات لتحديد السمية الخلوية للخلايا القاتلة الطبيعية (NK) ضد الخلايا السرطانية المستهدفة. يحدد الاختبار إطلاق إنزيم نازعة هيدروجين اللاكتات السيتوبلازمي من الخلايا السرطانية عن طريق قياس امتصاص المنتج ذو اللون الأحمر المتكون.

البروتوكول

1. فحص السمية الخلوية: بروتوكول الفحص

1. استخدم قاعا مستديرا ، لوحا معالجا بثقافة 96 بئرا لإعداد اللوحة كما هو مقترح في الجدول 1. يعرض هذا الجدول عناصر التحكم التجريبية و 3 مجموعات من الأعمدة التجريبية NK. يمكن توسيع هذا إلى ما مجموعه 10 أعمدة تجريبية من NK في صفيحة مكونة من 96 بئرا.
2. قم بالطرد المركزي للوحة الفحص عند 250 × جم لمدة 4 دقائق للتأكد من أن المستجيب والخلايا المستهدفة على اتصال. احتضان اللوحة المكونة من 96 بئرا لمدة 5 ساعات في حاضنة غرفة مرطبة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2} لتحقيق اتصال وافر بين الخلايا المستهدفة والمستجيبة وتحلل الخلية المستهدفة بواسطة الخلايا المستجيبة.
   ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
3. قبل 45 دقيقة من حصاد المواد الطاففة ، أضف 10 ميكرولتر من محلول التحلل 10x إلى آبار إطلاق LDH القصوى للخلية المستهدفة (الآبار 1E و 1F و 1G و 1H) وضع اللوحة مرة أخرى في الغرفة المرطبة.
4. بعد اكتمال وقت الحضانة ، قم بالطرد المركزي للوحة عند 250 × جم لمدة 4 دقائق. باستخدام ماصة متعددة القنوات ، انقل 50 ميكرولتر من الحصص من جميع الآبار إلى لوحة فحص جديدة ذات قاع مسطح 96 بئرا.
   ملاحظه: لا تلمس قاع الآبار حتى لا يتم نقل الخلايا إلى لوحة الفحص الطازجة. لا تستخدم صفيحة معالجة مستنبتة كلوحة فحص طازجة.

2. قم بعمل كاشف الفحص.

1. بعد وصول المخزن المؤقت للفحص إلى درجة حرارة الغرفة ، أضف 12 مل من المخزن المؤقت للفحص إلى زجاجة واحدة من مزيج الركيزة. اقلبها ورجيها برفق حتى تذوب تماما. 1 زجاجة تكفي لطبقين 96 بئر.
   ملاحظه: يجب حماية المخزن المؤقت للفحص من الضوء أثناء إذابته. تخلط مباشرة قبل الاستخدام.
2. أضف 50 ميكرولتر من كاشف الفحص إلى جميع الآبار في لوحة الفحص من الخطوة 4.6. قم بتغطية الطبق بورق الألمنيوم لحمايته من الضوء واحتضانه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظه: يجب تخزين كاشف الفحص المصنوع حديثا في الفريزر. الكاشف جيد لمدة 8 أسابيع تقريبا.
3. أضف 50 ميكرولتر من محلول التوقف لكل بئر. اقرأ اللوحة في غضون ساعة واحدة بعد إضافة Stop Solution وسجل الامتصاص عند 490 نانومتر
   وترد البيانات التمثيلية في الجدول 2.

< p class = "jove_content" > الجدول 1: تخطيط لوحة الفحص. TCS = إطلاق LDH التلقائي للخلية المستهدفة (50 ميكرولتر من الخلايا المستهدفة + 50 ميكرولتر وسط الخلية المستهدفة) ؛ TCM = الحد الأقصى لإطلاق LDH للخلية المستهدفة (50 ميكرولتر من الخلايا المستهدفة + 50 ميكرولتر وسط الخلية المستهدفة) ؛ VCC = التحكم في تصحيح مستوى الصوت (50 ميكرولتر وسط الخلية المستهدفة + 50 ميكرولتر وسط خلية NK) ؛ CMB = التحكم في خلفية الثقافة المتوسطة (50 ميكرولتر وسط الخلية المستهدفة + 50 ميكرولتر وسط خلية NK) ؛ ECSR = الإطلاق التلقائي للخلية المستجيبة (50 ميكرولتر من الخلايا القاتلة الطبيعية + 50 ميكرولتر من الخلايا NK المتوسطة) ؛ الحرب الإلكترونية = الآبار التجريبية (50 ميكرولتر من الخلايا المستهدفة + 50 ميكرولتر من الخلايا القاتلة الطبيعية).

1 2 3 4 5 TCS بطاقة رأس المال الافتراضي مركز الإمارات للدراسات والبحوث الاجتماعية (ECSR-1) مركز الإمارات للدراسات والبحوث الاستراتيجية - 2 مركز الإمارات للدراسات الاستراتيجية-3 TCS بطاقة رأس المال الافتراضي مركز الإمارات للدراسات والبحوث الاجتماعية (ECSR-1) مركز الإمارات للدراسات والبحوث الاستراتيجية - 2 مركز الإمارات للدراسات الاستراتيجية-3 TCS بطاقة رأس المال الافتراضي مركز الإمارات للدراسات والبحوث الاجتماعية (ECSR-1) مركز الإمارات للدراسات والبحوث الاستراتيجية - 2 مركز الإمارات للدراسات الاستراتيجية-3 TCS بطاقة رأس المال الافتراضي مركز الإمارات للدراسات والبحوث الاجتماعية (ECSR-1) مركز الإمارات للدراسات والبحوث الاستراتيجية - 2 مركز الإمارات للدراسات الاستراتيجية-3 الطب الصيني التقليدي CMB إي دبليو -1 إي و-2 إي و-3 الطب الصيني التقليدي CMB إي دبليو -1 إي و-2 إي و-3 الطب الصيني التقليدي CMB إي دبليو -1 إي و-2 إي و-3 الطب الصيني التقليدي CMB إي دبليو -1 إي و-2 إي و-3

الجدول 2: بيانات الامتصاص الخام للوحة الفحص التي تحتوي على الضوابط التجريبية في العمودين 1 و 2 والآبار التجريبية لقياس السمية الخلوية لخلايا NK المشيمية من فئران NP و RUPP ضد الخلايا المستهدفة YAC1.

1 2 3 4 5 NP روب NP 0.615 0.484 0.473 0.463 0.471 0.586 0.484 0.458 0.474 ربيع 0.469 0.61 0.486 0.464 دولار 0.459 0.469 0.605 0.55 0.524 0.526 0.543 0.576 0.504 0.519 0.502 0.528 00.528 دولار 0.565 0.512 0.515 ربيع 0.513 0.531 0.563 0.581 0.526 0.508 0.519

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 96 بئر لوحة زراعة الأنسجة سيلتريت هاتف: 229190 معقم ، قاع مستدير مكشطة الخلية صياد 8100241 Cytotox 96 مجموعة فحص السمية الخلوية غير المشعة بروميجا جي 1780 RPMI جيبكو 11875135 1640 متوسط خلية YAC-1 ATCC TIB-160