تقنية لإنشاء منصة توصيل جديدة لإطلاق الانفجار المتأخر للجزيئات

الملخص

المصدر: Arun Kumar ، S. et al. ، إنتاج منصة توصيل لقاح حساسة للأشعة تحت الحمراء القريبة من الغلاف الأساسي.J. Vis. Exp. (2020)

يوضح هذا الفيديو طريقة لتوليد فقاعة بوليمر أو منصة جديدة قائمة على الفقاعات المتعددة تتيح إطلاق الانفجار المتأخر. تستخدم البوليمرات القائمة على البوليستر لتشكيل الفقاعات المتعددة ذات الهيكل الأساسي ، ويمكن استخدام الجزيئات والمستضدات الصغيرة كبضائع.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تخليق بولي كابرولاكتون ثلاثي الأكريلات (PCLTA)

1. جفف 3.2 مل من 400 Da polycaprolactone (PCL) triol بين عشية وضحاها عند 50 درجة مئوية في قارورة مفتوحة 200 مل مستديرة القاع وكربونات البوتاسيوم (K₂CO₃) في قارورة زجاجية عند 90 درجة مئوية.
2. امزج الثلاث مع 6.4 مل من ثنائي كلورو الميثان (DCM) و 4.246 جم من K₂CO₃ تحت الأرجون.
3. امزج 2.72 مل من كلوريد الأكريلويل في 27.2 مل من DCM وأضفه بالتنقيط إلى خليط التفاعل في القارورة لمدة 5 دقائق.
4. غطي خليط التفاعل بورق الألمنيوم واتركيه دون إزعاج في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة تحت الأرجون.
5. بعد 24 ساعة ، قم بتصفية خليط التفاعل باستخدام ورق ترشيح على قمع Buchner تحت الفراغ للتخلص من الكواشف الزائدة.
6. ترسيب الترشيح من الخطوة 1.5 التي تحتوي على البوليمر المغلف في ثنائي إيثيل الأثير في 1: 3 (vol / vol) و rotavap عند 30 درجة مئوية لإزالة ثنائي إيثيل الأثير.

< p class = "jove_title" >2. تشكيل الفقاعات المتعددة

ملاحظة: قد يؤدي حقن البوليمر في الماء منزوع الأيونات (DI) إلى هجرة الفقاعات المتعددة إلى قاع القارورة مما يؤدي إلى قاع مسطح. استخدم 10٪ (الوزن / الحجم) كربوكسي ميثيل السليلوز (CMC) لملء القارورة الزجاجية بدلا من ذلك لتجنب تسطيح الفقاعات.

1. تحضير محلول CMC بنسبة 10٪ (بالوزن / الحجم) في ماء DI.
2. املأ قارورة زجاجية سعة 0.92 مل ب 0.8 مل من 10٪ CMC باستخدام ماصة نقل سعة 1 مل.
3. امزج 1000 مجم / مل من 14 كيلو دالتون PCL في DCM وقم بتصنيع PCLTA في 1: 3 (حجم / حجم) لحجم إجمالي قدره 200 ميكرولتر أو قم بإعداد 200 ميكرولتر من 1000 مجم / مل من 5 كيلو دالتون بولي (حمض اللاكتيك كو جليكوليك) دياكريلات (PLGADA) في الكلوروفورم.
4. امزج خليط 2-هيدروكسي -4 ′ - (2-هيدروكسي إيثوكسي) -2-ميثيل بروبيوفينون (البادئ الضوئي) مع خليط البوليمر (PLGADA أو PCL / PCLTA) في 0.005: 1 (vol / vol).
5. قم بتحميل 200 ميكرولتر من خليط البوليمر في حقنة زجاجية سعة 1 مل مثبتة على مضخة حقنة متصلة بأنبوب من الفولاذ المقاوم للصدأ بقطر داخلي يبلغ 0.016 بوصة.
6. استخدم محركا صغيرا للتحكم في الحركة الأمامية والخلفية لأنبوب البوليمر لحقن البوليمر في CMC بنسبة 10٪ في القارورة الزجاجية لتشكيل الفقاعات المتعددة.
7. عالج الفقاعات المتعددة تحت الأشعة فوق البنفسجية (UV) بطول موجي 254 نانومتر لمدة 60 ثانية عند 2 واط / سم².
قم
8. بتجميد الفقاعات المتعددة في النيتروجين السائل وتجميدها طوال الليل عند فراغ 0.010 ملي بار وعند -85 درجة مئوية.
9. افصل الفقاعات المتعددة عن CMC المجفف باستخدام الملقط واغسل الفقاعات المتعددة بماء DI لإزالة أي بقايا CMC. لاحظ أنه يمكن استخدام البوليمرات الأخرى على الأرجح مع تعديلات لتغيير حركية الإطلاق.

فئة

3. تعديل قطر الفقاعات المتعددة

1. املأ قارورة زجاجية سعة 0.92 مل ب 10٪ CMC باستخدام ماصة نقل سعة 1 مل.
2. امزج PCL / PCLTA في 1: 3 (حجم / حجم) مع 1000 مجم / مل 14 كيلو دالتون PCL وقم بتجميع PCLTA. امزج المبدئ الضوئي مع خليط بوليمر في 0.005: 1 (vol / vol).
3. قم بتحميل خليط البوليمر في حقنة زجاجية سعة 1 مل مثبتة على مضخة حقنة متصلة بأنبوب من الفولاذ المقاوم للصدأ بقطر داخلي يبلغ 0.016 بوصة.
4. استخدم محركا صغيرا للتحكم في الحركة الأمامية والخلفية لأنبوب البوليمر لحقن البوليمر في CMC بنسبة 10٪ في القارورة الزجاجية لتشكيل الفقاعات المتعددة.
5. للحصول على فقاعات متعددة بأقطار مختلفة ، قم بتغيير معدل الاستغناء من 0.0005 إلى 1 ميكرولتر / ثانية.
6. التقط صورا للقارورة مع الفقاعات المتعددة ذات القطر المختلف.
7. استخدم ImageJ لتحديد قطر الفقاعات المتعددة واستخدم حجم القارورة كمقياس.

فئة

4. توسيط البضائع داخل polybubble

1. تعديل لزوجة PCL/PCLTA باستخدام K₂CO₃:
   ملاحظه: لا يلزم تعديل لزوجة PLGADA باستخدام K₂CO₃ لأن لزوجة 5 كيلو دالتون PLAGDA عند 1000 مجم / مل كافية لتوسيط البضائع.
   1. أضف K₂CO₃ (الذي تم عزله بعد تفاعل PCLTA) إلى PCLTA بتركيزات متفاوتة بما في ذلك 0 مجم / مل و 10 مجم / مل و 20 مجم / مل و 40 مجم / مل و 60 مجم / مل
   .
   2. قياس اللزوجة الديناميكية للمحاليل عن طريق تغيير معدل القص من 0 إلى 1000 1/s باستخدام قياس الريومتر.
   3. حقن الحمولة يدويا في المنتصف (راجع الخطوة 4.2 لتحضير خليط البضائع) من الفقاعات المتعددة التي تم تشكيلها باستخدام محاليل PCL / PCLTA بتركيزات مختلفة من K₂CO₃ (الخطوة 4.1.1). حدد التركيز الأمثل ل K₂CO₃ من خلال ملاحظة المحلول من الخطوة 4.1.1 يمكن أن يؤدي إلى الاحتفاظ بالحمولة في المنتصف.
2. توسيط الشحنة (تظهر بالفعل جدوى مع جزيئات صغيرة) مع CMC
   1. امزج الحمولة مع 5٪ (بالوزن / الحجم) CMC في دوار طوال الليل لزيادة لزوجة الحمولة.
   قم
   2. بحقن 2 ميكرولتر يدويا من خليط البضائع في الفقاعات المتعددة واستمر في المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية بطول موجي 254 نانومتر لمدة 60 ثانية عند 2 واط / سم².
   قم
   3. بتجميد الفقاعات المتعددة في النيتروجين السائل لمدة 30 ثانية وتجميدها طوال الليل عند 0.010 ملي بار فراغ وعند -85 درجة مئوية.
   4. افصل الفقاعات المتعددة عن CMC المجفف باستخدام ملقط واغسلها بماء DI لإزالة أي بقايا CMC.
   5. قم بقص الفقاعات المتعددة إلى نصفين وقم بتصوير النصفين باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر للتأكد من أن الحمولة متمركزة (راجع الخطوة 6 لمعرفة الأطوال الموجية للإثارة والانبعاث المستخدمة).

فئة

5. صياغة البضائع

ملاحظة: يمكن أن تحتوي تركيبة Polybubble على أنواع مختلفة من البضائع ، بما في ذلك الجزيئات الصغيرة والبروتينات والأحماض النووية.

1. بناء على الدراسات السابقة ، في حالة شحنات البروتين ، استخدم سواغات بما في ذلك البولي إيثيلين جلايكول (PEG) ، والبولي فينيل بيروليدون (PVP) ، والبوليمرات السكرية لتحسين استقرار البروتين أثناء صياغة الفقاعات.
2. قم بتكوين فقاعات متعددة استنادا إلى البروتوكول في الخطوة 2.
3. تحضير محلول المستضد بإضافة 17.11 جم من التريهالوز إلى 625 ميكرولتر من مستضد فيروس نقص المناعة البشرية gp120 / 41.
4. حقن 1 ميكرولتر من محلول المستضد يدويا في منتصف الفقاعات المتعددة.
5. افتح الفقاعات المتعددة في الأيام 0 و 7 و 14 و 21 ، وسجل مضان المستضد بأطوال موجية للإثارة والانبعاث 497 نانومتر و 520 نانومتر على التوالي.
6. حدد وظائف المستضد باستخدام مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) واستخدم 5٪ من الحليب الخالي من الدسم كمخزن مؤقت مانع.

< p class = "jove_title" >6. الإفراج عن البضائع

ملاحظة: يمكن استخدام جزيء صغير أو مستضد كنوع شحنة

1. جزيء صغير
   1. احتضان الفقاعات المتعددة مع الأكريفلافين المركزي في 400 ميكرولتر من محلول ملحي عازل للفوسفات (PBS) عند 37 درجة مئوية ، 50 درجة مئوية للفقاعات المتعددة PLGADA وعند 37 درجة مئوية ، 50 درجة مئوية ، 70 درجة مئوية للفقاعات المتعددة PCL / PCLTA.
      ملاحظه: السبب الذي يجعلنا نوصي باختبار درجات حرارة الجسم فوق أ) محاكاة درجة الحرارة (50 درجة مئوية) التي تصل عندها الفقاعات المتعددة أثناء الليزر للقضبان النانوية الذهبية (AuNRs) داخل PCL و PLGA. و ب) تسريع عملية تحلل PCL (50 درجة مئوية ، 70 درجة مئوية).
   2. في كل نقطة زمنية ، اجمع المواد الطافية واستبدلها ب 400 ميكرولتر من PBS الطازج.
   3. استخدم قارئ الألواح لتحديد شدة التألق في المواد الطافية التي تم جمعها.
      ملاحظه: استخدم ex / em من 416 نانومتر / 514 نانومتر للأكريفلافين.
2. مستضد
   1. احتضان الفقاعات المتعددة مع مصل الألبومين البقري المركزي (BSA) -488 في 400 ميكرولتر من PBS عند 37 درجة مئوية ، 50 درجة مئوية للفقاعات المتعددة PLGADA وعند 37 درجة مئوية ، 50 درجة مئوية للفقاعات المتعددة PCL / PCLTA.
   2. في كل نقطة زمنية ، اجمع المواد الطافية واستبدلها ب 400 ميكرولتر من PBS الطازج.
   3. استخدم قارئ الألواح لتحديد شدة التألق في المواد الطافية التي تم جمعها. استخدم ex / em من 497 نانومتر / 520 نانومتر ل BSA-488.
      ملاحظه: لا ينبغي إجراء دراسة الإطلاق عند 70 درجة مئوية للفقاعات المتعددة PCL / PCLTA لتجنب تعريض المستضد لدرجات الحرارة القصوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 1-خطوة الترا رباعي ميثيل بيزيدين (TMB) - محلول الركيزة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) حراري علمي 34028 2-هيدروكسي-2-ميثيل بروبيوفينون TCI أمريكا H0991 450 نانومتر حل التوقف للركيزة TMB أبكام أب17152 كلوريد الأكريلويل سيجما ألدريتش أ 24109-100 جرام أكريفلافين كيم إمبكس الدولية هاتف: 22916 إيثيل الأثير اللامائي فيشر للكيماويات E138-500 الأجسام المضادة لفيروس نقص المناعة البشرية 1 gp120 المترافقة مع بيروكسيداز الفجل الحار (HRP) ألبومين مصل الأبقار (BSA) فيشر الكواشف الحيوية BP9700100 BSA-CF488 صبغة مترافقة إنفيتروجين أ 13100 كربوكسي ميثيل سلولوز (CMC) ميليبور سيجما 80502-040 كلوروفورم فيشر للكيماويات سي 2984 طلاء عازلة أبكام أب210899 ثنائي كلورو ميثان (DCM) سيجما ألدريتش 270997-1 لتر ثنائي إيثيل الأثير فيشر للكيماويات [إ1384] مضخة حقنة Legato 100 دينار كويتي علمي 14 831 212 الحليب الجاف الخالي من الدسم أندوين العلمي NC9022655 كربونات البوتاسيوم أكروس أورجانكس AC424081000 عازلة محلول الفوسفات الملحي فيشر الكواشف الحيوية ص3991 (بولي (كابرولاكتون) سيجما ألدريتش 440744-250 جرام (بولي (كابرولاكتون) تريول أكروس أورجانكس AC190730250 بولي (حمض اللاكتيك كو جليكوليك) دياكريلات CMTec هاتف: 280050 مؤتلف فيروس نقص المناعة البشرية 1 gp120 + بروتين gp41 أبكام أب49054 تريهالوز أكروس أورجانكس NC9022655