اختبار لتقييم التأثيرات المضادة للسرطان للطافي الخالي من الخلايا اللبنية

الملخص

المصدر: Lee، J.، et al. تقييم موت الخلايا باستخدام مادة طافية خالية من الخلايا للبروبيوتيك في الثقافات الكروية ثلاثية الأبعاد لخلايا سرطان القولون والمستقيم. J. Vis. Exp. (2020).

يوضح هذا الفيديو فحصا في المختبر لدراسة التأثيرات المضادة للسرطان للطافي الخالي من الخلايا الملبنة (LCFS). عند تعريض كرويات سرطان القولون والمستقيم لجرعات متفاوتة من LCFS ، يؤدي التفاعل مع المستقلبات البكتيرية في LCFS إلى موت الخلايا المبرمج في الخلايا السرطانية ، مما يؤدي إلى تعطيل البنية الكروية ويؤدي إلى موت الخلايا بطريقة تعتمد على الجرعة.

البروتوكول

< ص الفئة = "jove_title" >1. مزارع الخلايا البكتيرية وتحضير الطاف الخالي من الخلايا اللبنية (LCFS)

ملاحظة: يتم إجراء الخطوات من 1.2 إلى 1.9 في غرفة لاهوائية.

1. قم بإعداد طبق أجار De Man-Rogosa-Sharpe (MRS) ومرق يحتوي على L-cysteine وتعقيمه عن طريق التعقيم.
قم
2. باحتضان صفيحة أجار MRS مسبقا في غرفة H₂ اللاهوائية التي يتم الحفاظ عليها عند 37 درجة مئوية مع 20 جزء في المليون من الأكسجين.
3. قم بإذابة مخزون بكتيري Lactobacillus وتلقيح صفيحة الأجار بالثقافة البكتيرية (الشكل 1 أ (ط)).
4. احتضان البكتيريا لمدة 2-3 أيام في غرفة H₂ اللاهوائية عند 37 درجة مئوية و 20 جزء في المليون من الأكسجين حتى يتم الحصول على مستعمرات بكتيرية مفردة.
5. اغسل وجفف أنبوب الثقافة لاالنوعي من Hungate. قم بتعقيم أنبوب الثقافة عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
6. ثم احتضان الأنبوب في غرفة H₂ اللاهوائية عند 37 درجة مئوية و 20 جزء في المليون من الأكسجين لإزالة الأكسجين.
7. ضع 2-3 مل من مرق MRS في الأنبوب. أغلق الأنبوب بسدادة مطاطية من البوتيل وقم بلف الغطاء.
8. احصل على مستعمرة واحدة بحلقة وضعها في أنبوب الاستزراع سعة 1.5 مل مع 500 ميكرولتر من 1x PBS. (الشكل 1 أ (2)).
9. قم بتعليق المستعمرة باستخدام حقنة سعة 1 مل (الشكل 1 أ (ثالثا)). افعل ذلك عن طريق إدخال إبرة المحقنة سعة 1 مل في وسط غطاء الأنبوب ، وشفط المستعمرة المعلقة ثم إعادة تعليقها مرة أخرى في وسائط مرق MRS. (الشكل 1 أ (رابعا)).
10. احتضان وسائط مرق MRS في حاضنة شاكر لمدة يومين (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ ، 200 دورة في الدقيقة).
11. قم بقياس الكثافة الضوئية (OD) باستخدام مقياس الطيف الضوئي لمراقبة منحنيات نمو البكتيريا حتى يصل الامتصاص عند OD₆₂₀ إلى 2.0.
12. افصل الكريات البكتيرية عن الوسائط المكيفة عن طريق الطرد المركزي عند 1,000 × جم لمدة 15 دقيقة. اغسل الكريات البكتيرية المجمعة باستخدام 1x PBS وأعد تعليقها في 4 مل من RPMI 1640 مع مصل بقري جنيني بنسبة 10٪. لا تقم بتضمين أي مضادات حيوية في الوسط.
13. حافظ على الكريات البكتيرية في RPMI واحتضانها في حاضنة شاكر لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂ بسرعة 100 دورة في الدقيقة.
14. لتحضير المادة الطافية للبروبيوتيك ، قم بإزالة الحبيبات البكتيرية عن طريق الطرد المركزي عند 1000 × جم ، لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. قم بتصفية المادة الطافية المستردة باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر وتخزينها في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

2. توليد الكرويات

1. تحضير خطوط خلايا سرطان القولون والمستقيم
   1. قم بزراعة خطوط خلايا DLD-1 و HT-29 و WiDr كطبقات أحادية حتى التقاء 70-80٪ واحتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون_{بنسبة 5}٪ (وسط النمو: RPMI يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ بنسلين ستربتومايسين).
   2. بالنسبة للخلايا المزروعة في طبق بتري 100 مم ، اغسل الطبق مرتين باستخدام 4 مل من 1x PBS. أضف 1 مل من 0.25٪ تريبسين EDTA واحتضن طبق بتري لمدة دقيقتين عند 37 درجة مئوية في حاضنة 5٪ CO₂ لفصل الخلايا.
   3. بعد الحضانة ، تحقق من تفكك الخلية تحت المجهر وقم بتحييد التربسين EDTA ب 5 مل من وسط النمو.
   4. انقل الخلايا المنفصلة إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل وجهاز طرد مركزي لمدة 3 دقائق عند 300 × جم.
   5. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليقها برفق باستخدام 3 مل من وسائط النمو.
   6. عد الخلايا باللون الأزرق لتحديد الخلايا القابلة للحياة باستخدام مقياس كثافة الدم. (الشكل 1 ب (ط))
2. تشكيل كروي
   1. في أنبوب مخروطي سعة 15 مل ، قم بتخفيف الخلايا من 2.1.5 للحصول على 1 - 2 × 10⁵ خلايا / مل (الشكل 1 ب (2))
   2. أضف التركيز النهائي ل 0.6٪ ميثيل السليلوز إلى تعليق الخلية وانقل الخلايا المخففة إلى خزان معقم.
      ملاحظة: لكل خط خلية ، يجب معايرة كمية ميثيل السليلوز المطلوبة وتحديدها وفقا لذلك.
   3. استخدم ماصة متعددة القنوات لتوزيع 200 ميكرولتر من الخلايا على كل بئر من صفيحة دقيقة ذات قاع دائري منخفض للغاية مكون من 96 بئرا. (الشكل 1 ب (ثالثا))
   4. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية في حاضنة 5٪ CO₂ لمدة 24-36 ساعة.
   5. بعد 24 - 36 ساعة ، راقب اللوحة تحت المجهر الضوئي لضمان تكوين كروي.

< p class = "jove_title" >3. علاج خلايا سرطان القولون والمستقيم ثلاثية الأبعاد باستخدام LCFS

1. إنشاء كرويات كما هو موضح في الخطوتين 2 و3.
2. قبل إجراء علاج LCFS ، قم بإذابة LCFS المجمدة في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 10-20 دقيقة.
3. قم بتلقيح محلول مخزون LCFS في وسط نمو. يخفف بشكل متسلسل إلى 25٪ و 12.5٪ و 6٪ في وسط النمو (أي 25٪ LCFS = 150 ميكرولتر من وسط النمو + 50 ميكرولتر من LCFS).
4. أخرج صفيحة زراعة الخلايا التي تحتوي على كرويات من الحاضنة وقم بإزالة أكبر قدر ممكن من وسط النمو من كل بئر باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر.
5. أضف وسائط النمو مع LCFS على الخلايا واحتضانها عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون_{بنسبة 5}٪ لمدة 24 - 48 ساعة
   ملاحظه: سيعتمد الحجم المراد استخدامه على حجم اللوحة على النحو التالي: 2 مل لألواح زراعة الخلايا المكونة من 6 آبار ؛ 200 ميكرولتر لألواح زراعة الخلايا ذات 96 بئر.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: التمثيل التخطيطي للتكوين الكروي وإعداد LCFS.

< p class = "jove_content" > (A) يتم تمييز صور التمثيل التخطيطي لبروتوكول إنشاء LCFS ب (i-iv) (ب) يتم تمييز مخططات التكوين الكروي بوساطة ميثيل السليلوز ب (i-iii).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات النظم الحيوية التطبيقية MicroAmp فيلم لاصق بصري ثيرمو فيشر العلمي 4311971 100 غطاء أنبوب الطرد المركزي الدقيق MaxyClear Snaplock سعة 2.0 مل ، بولي بروبيلين ، شفاف ، غير معقم ، 500 أنبوب / عبوة ، 10 عبوات / علبة كورنينج SCT-200-C 500 أنبوب / حزمة ، 10 عبوات / علبة BD Difco باكتو أجار دينار بحريني هاتف: 214010 500 جرام BD Difco Lactobacilli MRS مرق دينار بحريني DF0881-17-5 500 جرام محلول ملحي مخزن بالفوسفات من كورنينج ، 1X بدون الكالسيوم والمغنيسيوم ، درجة الحموضة 7.4 ± 0.1 كورنينج 21-040-السيرة الذاتية 500 مل Falcon 5 مل أنبوب اختبار البوليسترين القاع المستدير ، مع غطاء المفاجئ لمصفاة الخلية كورنينج 352235 25 / حزمة ، 500 / علبة مصل الأبقار الجنينية، معتمد، أمريكي المنشأ ثيرمو فيشر العلمي 16000044 500 مل العصيات اللبنية الخمرة مجموعة كورية لثقافات النوع KCTC 3112 L-سيستين هيدروكلوريد مونوهيدرات سيجما ألدريتش C6852-25G 25 جرام ميثيل السليلوز (3500-5600 ميجا باسكال ، 2٪ في الماء عند 20 درجة مئوية) TCI م 0185 500 جرام لوحة تفاعل بصرية سريعة من MicroAmp بسعة 96 بئر مع باركود ، 0.1 مل الأنظمة الحيوية التطبيقية 4346906 20 صحن وحدة تصفية حقنة Millex-GS ، 0.22 ميكرومتر ، استرات السليلوز المختلطة ، 33 مم ، أكسيد الإيثيلين المعقم ميليبور SLGS033SB 250 حيا البنسلين الستربتومايسين (10,000 وحدة / مل) ثيرمو فيشر العلمي 15140122 100 مل RPMI-1640 جيبكو 11875-119 500 مل التربسين EDTA (0.25٪) ، أحمر الفينول ثيرمو فيشر العلمي 25200056 100 مل المواد / المعدات / البرامج حاضنة ثاني أكسيد الكربون₂ ثيرمو فيشر HERAcell 150i أنبوب مخروطي 15 مل الاسكتلندي 50015 أنبوب مخروطي 50 مل الاسكتلندي 50050 لوحة الآبار المتعددة المنخفضة للغاية من Corning Costar سيجما ألدريتش CLS7007 لوحة الآبار المتعددة المنخفضة للغاية من Corning Costar سيجما ألدريتش CLS3471 خزانات كاشف كوستار 50 مل ، 5 / كيس ، معقمة كوستار 4870 شرائح غرفة عد خلايا الكونتيسة ثيرموفيشر ج 10228 عداد الخلايا الآلي للكونتيسة الثانية FL إنفيتروجين AMQAF1000 قارئ EnSpire متعدد الأوضاع بيركين إلمر إنبرازي 2300 ماصة Eppendorf Research Plus متعددة القنوات، 8 قنوات إيبندورف 3122000051 شاكر محتضن رفيق المختبر سيف - 6000 آر متعدد المقاييس الإصدار 3.0 ، فوجي فيلم طوكيو، اليابان الكثافة الضوئية (OD) LAMBDA UV / Vis Spectrophotometers بيركين إلمر والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية مجهر تباين الطور أوليمبوس طوكيو، اليابان أنبوب الطرد المركزي الصغير SPL 1.5 مل الاسكتلندي 60015 خزانات SPL متعددة القنوات ، 12 قناة ، PS ، معقمة الاسكتلندي 21012 معالجات السوائل بالموجات فوق الصوتية Vibra-Cell خلية سونيكس فيبرا في سي 505 معالج بالموجات فوق الصوتية 500 وات غرفة الفينيل اللاهوائية منتجات مختبر كوي