$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
< p class = "jove_title" >
1. معالجة دم الحبل السري وعزل الخلايا الجذعية / السلفية البشرية المكونة للدم (HSPCs)
- قم بتنفيذ جميع خطوات البروتوكول في ظل ظروف معقمة في خزانات التدفق الصفحي.
- خذ دم الحبل السري (CB) الذي تم جمعه في أنابيب هيبارينية واجعل حجمه يصل إلى 35 مل عن طريق إضافة محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). ضع العينة فوق وسط فصل الخلايا الليمفاوية (LSM) كما هو موضح في الشكل 1 وقم بالطرد المركزي LSM باستخدام CB ذي الطبقات عند 400 × جم لمدة 35 دقيقة عند 4 درجات مئوية بدون فرامل.
ملاحظه: خفف الدم بعناية وبرفق لتجنب الاختلاط عند الواجهة.
- قم بإزالة طبقة LSM والبلازما العلوية بعناية وانقل واجهة طبقة الطلاء الأبيض إلى أنبوب جديد باستخدام ماصة النقل.
- أعد تعليق الطبقة المصنوعة من البهجة في 30-40 مل من المخزن المؤقت المثلج (PBS + 0.5٪ ألبومين مصل البقر [BSA] + 2 ملي مولار حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك [EDTA]). باستخدام ماصة ، امزج 20 ميكرولتر من تعليق الخلية مع 20 ميكرولتر من 0.4٪ تريبان بلو وماصة 10 ميكرولتر من الخليط في الفتحة الخارجية لأي من غرفتي شريحة العد وأدخل الشريحة في عداد خلية آلي لحساب الخلايا.
ملاحظه: استخدم المخزن المؤقت المثلج في جميع الخطوات ، لأنه يساعد في الحفاظ على الخلايا قابلة للحياة.
- قم بالطرد المركزي للخلايا عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية وشفط المادة الطافية بعناية. ثم أضف 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت المثلج.
- أضف 100 ميكرولتر من كاشف حجب مستقبلات Fc البشري و 100 ميكرولتر من الحبيبات الدقيقة المترافقة بالأجسام المضادة CD34 للفأر أحادية النسيلة لما يصل إلى 1 × 108 خلايا (انظر جدول المواد). احتضن لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، وأضف 10 مل من المخزن المؤقت المثلج لغسل الخلايا ، وجهاز الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية
ملاحظة: قم بتوسيع نطاق هذا وفقا لرقم الخلية في حالة وجود أكثر من 1 × 108 خلايا.
- قم بإزالة المادة الطافية بعناية ، وأعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت ، واستمر في خطوة الفصل المغناطيسي لإثراء HSPCs.
- ضع عمود LS للتحديد الموجب (انظر جدول المواد) في مجال فرز الخلايا المنشط مغناطيسيا وقم بتمريره بسعة 3 مل من المخزن المؤقت.
- قم بتحميل العينة إلى عمود LS الذي يمكنه حبس الميكروبيدات المرتبطة ب CD34 + البشري في العينات والسماح لها بالتدفق تحت تأثير الجاذبية إلى أنبوب التجميع.
- اغسل العمود 3x مع المخزن المؤقت واجمع الأنبوب في نفس أنبوب التجميع من CD34- جزء من الخلايا.
- اغمر العمود بسعة 5 مل من المخزن المؤقت لمسح خلايا CD34 + في أنبوب تجميع جديد. كرر الإجراء لتحقيق نقاء >90٪.
- عد خلايا CD34+ المملوءة باستخدام صبغة التريبان الزرقاء في مقياس كثافة الدم. بعد العد ، قم بالطرد المركزي لخلايا CD34 + عند 300 × جم لمدة 5 دقائق وتخلص من المادة الطافية.
- أعد تعليق خلايا CD34 + في 25 ميكرولتر من PBS لاستخدامها على الفور في الزرع أو حفظ الخلايا بالتبريد بتركيز 1-2 مليون / مل في وسط التجميد (وسط معهد روزويل بارك التذكاري [RPMI 1640 متوسط] + 50٪ مصل بقري للجنين (FBS) + 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد [DMSO]) لمزيد من الاستخدام في الزرع. < / >
ملاحظه: أعد دائما عد الخلايا القابلة للحياة قبل استخدامها في الزرع.
- للتحقق من نقاء الملح CD34 + ، خذ 50 ميكرولتر من المعلق واحتضنه ب 10 ميكرولتر من الجسم المضاد ل phycoerythrin أو الجسم المضاد CD34 المترافق مع PE لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. بعد حضانة الجسم المضاد ، اغسل الخلايا الملطخة باستخدام PBS ، وأعد تعليقها في 100 ميكرولتر من PBS ، ثم تابع إجراء قياس التدفق الخلوي. أضف أنبوبا إضافيا من الخلايا بدون جسم مضاد لتصميم البوابة في مقياس التدفق الخلوي.
- بعد الاستحواذ ، قم بتحليل البيانات عن طريق تحديد منطقة الاهتمام على مخطط التشتت الأمامي (FSC) والمبعثر الجانبي (SSC) ، متبوعا ببوابة للخلايا المفردة على مخططات منطقة FSC وارتفاع FSC. بوابة الخلايا الإيجابية CD34 على خلايا مفردة في قناة PE ومخطط منطقة SSC.
< p class = "jove_title" >
2. تحضير خلايا الكبد البشرية (HEPs) للزرع
- قم بإزالة خلايا الكبد المحفوظة بالتبريد من النيتروجين السائل ، واغمر القارورة بسرعة في الحمام المائي ، وقم بإذابة الثلج لمدة 90-120 ثانية تقريبا.
- قم بإزالة غطاء القارورة واسكب خلايا الكبد المذابة في الأنبوب المخروطي سعة 50 مل لوسط الذوبان الدافئ.
- قم بتعليق الخلايا عن طريق هز الأنبوب سعة 50 مل يدويا لبضع ثوان.
ملاحظه: لا تقم بتدوير الأنبوب.
- حبيبات الخلايا على حرارة 100 × جم لمدة 8 دقائق في درجة حرارة الغرفة. اغسل الخلايا المحببة في PBS باستخدام 0.1٪ BSA وقم بتجميعها إما باستخدام HSPCs طازجة أو مذابة (نسبة 10: 1) في PBS بحجم نهائي قدره 80 ميكرولتر / فأر.
فئة
3. التعامل مع وفحصها وتنميطها الجيني وعلاجها لزرع الخلايا الكبدية البشرية والخلايا الكبدية
- التعامل مع
- نتيجة لنقص المناعة الحاد ، قم بتربية الفئران TK-NOG وإيواءها والتعامل معها في ظروف معقمة.
- ارتد دائما معطف المختبر والقفازات وأغطية الأحذية وقناع الوجه لمنع الإصابة بالكائنات الحية الدقيقة التي يحتمل أن تكون مسببة للأمراض.
- استخدم قفازات وأدوات معقمة للجراحة وتعامل مع بشكل معقم طوال الجراحة.
- اختيار الفئران TK-NOG للتجربة
- الحفاظ على مستعمرة سلالة TK-NOG عن طريق تربية إناث الفئران TK-NOG مع ذكور من القمامة غير المعارف التقليدية واختيار ذرية معدلة وراثيا عن طريق التنميط الجيني.
ملاحظه: قم بإجراء التنميط الجيني (انظر الخطوة 3.3) لتحديد وجود أو عدم وجود الجين المعدل في ذكور وإناث الفئران حديثي الولادة في وقت الفطام.
- اختر الذكور في عمر 6-8 أسابيع للزرع بسبب حساسيتهم العالية لاستنفاد الخلايا الكبدية المعبرة عن الجينات المحورة لفيروس الهربس البسيط - المعارف التقليدية بوساطة GCV.
- ضع علامة على الفئران في وقت الفطام أو الجراحة لتسهيل التعرف عليها. قم بتدوين وزن وحالتها الصحية.
- التنميط الجيني لوجود الجينات المحورة HSV-TK باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي
- إجراء التنميط الجيني في وقت الفطام (عادة في عمر 3-4 أسابيع). للتنميط الجيني ، قم بقص قطعة من أذن الفأر في خزانة أمان بيولوجية ذات تدفق رقائقي للحفاظ على العقم واستخراج الحمض النووي الجيني باستخدام مجموعة عزل الحمض النووي الجيني.
- تضخيم الحمض النووي الجيني المستخرج من قطعة الأذن في خليط تفاعل 20 ميكرولتر للكشف عن الجينات المعدلة وراثيا HSV-TK تحت سيطرة محفز الألبومين البشري عن طريق إضافة 1 ميكرولتر من التمهيدي الأمامي 5'-CCATGCACCTTTTTATCCTGG-3 '، 1 ميكرولتر من التمهيدي العكسي 5'-TAAGTTGCAGCAGGGCGTC-3' ، 0.5 ميكرولتر من مسبار FAM 5′-FAM-AATCGCCCGCCGGCTGC-MGB-3 '، و 10 ميكرولتر من المزيج الرئيسي على أداة تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي (PCR).
- اضبط إعدادات تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي على النحو التالي: 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية (مرحلة القراءة المسبقة) ، 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق (مرحلة الانتظار) ، 40 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية و 60 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة (مرحلة PCR) ، و 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية (مرحلة ما بعد القراءة). < / >
ملاحظه: تعتبر دورة العتبة (Ct) أقل من 22 إيجابية للجين المعدل HSV-TK.
- العلاج باستخدام جانسيكلوفير وتريوسلفان
- باستخدام إبرة 27 جم ، حقن الفئران TK-NOG بحقن GCV داخل الصفاق (6 مجم / كغ) 2x يوميا في اليوم 7 وفي اليوم 5 في 100 ميكرولتر من المحلول الملحي قبل الجراحة لاستنفاد الخلايا المتني المعدلة وراثيا للفئران (كما هو موضح في الإستراتيجية التجريبية في الشكل 2).
- في الأيام 3 و 2 و 1 قبل الجراحة ، قم بوضع جرعات غير نخاعية داخل الصفاق من تريوسلفان (1.5 جم / كجم / يوم) في 100 ميكرولتر من المحلول الملحي ، باستخدام إبرة 27 جرام.
- قبل يوم واحد من الجراحة ، اسحب قطرتين إلى ثلاث قطرات (~ 100 ميكرولتر) من الدم من الوريد تحت الفك السفلي عن طريق وخزه بإبرة وخز 5 مم ، وعزل المصل عن طريق الطرد المركزي (1,500 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية) لمقايسة ألانين أمينوترانسفيراز (ALT) لتقييم درجة تلف الكبد.
- التحضير للجراحة
- استخدم المقصات لحلاقة فرو الفأر المحيط بموقع الشق (على يسار الجدار البريتوني) قبل الجراحة.
- اضبط تدفق الأكسجين على 1 لتر / دقيقة وتدفق الأيزوفلوران إلى 3٪ - 5٪ في غرفة الحث باستخدام آلة تخدير الماوس. ضع فأرا واحدا في كل مرة في غرفة الحث للتخدير.
- قم بتوصيل أحد طرفي أنبوب التمديد المعقم (بسعة تعليق تبلغ 550 ميكرولتر ؛ انظر جدول المواد للحصول على المواصفات) بإبرة 30 جم والطرف الآخر بحقنة سعة 1 مل.
- املأ المحقنة بالمعلق (80 ميكرولتر/الماوس) من ماصات HEPs وHSPCs المجمعة (انظر القسم 2)، وقم بتركيب المحقنة في شق ماصة التوزيع المتكررة، واضبط الموزع لتوزيع 10 ميكرولتر في كل مكبسة.
- بمجرد تخدير الفئران (عادة بعد 3-4 دقائق) ، قم بتبديل تدفق الأيزوفلوران إلى مخروط الأنف وقلل معدل تدفق الأيزوفلوران إلى 2٪ - 3٪.
- زرع داخل الطحال لخلايا الكبد الشهية العصبية البشرية وخلايا الكبد في الفئران
- قم بتنفيذ جميع خطوات الجراحة في خزانة التدفق الصفحي في ظل ظروف معقمة.
- ضع ستارة معقمة نظيفة على سطح العمل وافرك الجانب الأيسر من جسم كل فأر بنسبة 10٪ بوفيدون يود متبوعا بكحول الأيزوبروبيل بنسبة 70٪ ، قبل إجراء شق.
- قم بعمل شق صغير (~ 1 - 1.5 سم في الطول وعمق 5 مم) في الجلد والعضلات والصفاق على يسار الجدار البريتوني باستخدام مقص من نوع فانا لدخول التجويف البريتوني حوالي 5 مم تحت الحافة السفلية للقفص الصدري.
- حدد موقع الطحال ، واسحبه قليلا باستخدام ملقط إلى منطقة التشغيل لسهولة الوصول إليه ، وأدخل إبرة 30 G في القطب السفلي من الطحال.
- افتح مكبس ماصة التوزيع وقم بتوزيع 10 ميكرولتر من الحجم في المرة الواحدة، بحد أقصى 60-80 ميكرولتر لكل طحال. اسحب الإبرة ببطء وقم بقص الطحال بمشابك ربط باستخدام أداة الربط.
- ادفع الطحال مرة أخرى إلى تجويف الجسم باستخدام أدوات تطبيق ذات رؤوس قطنية مبللة ب PBS المعقم.
- أغلق الطبقة العضلية لجدار البطن باستخدام خياطة قابلة للامتصاص بنمط خياطة متقطعة (غير مستمر). أنجز إغلاق الجلد بنمط خياطة متقطعة باستخدام خيوط غير قابلة للامتصاص.
