تقنية لتوليد الخلايا التائية المستضدات الخيمرية الخاصة بالمستضد

الملخص

المصدر: Davidson, H.W., et al. توليد عالي الكفاءة للخلايا التائية الأولية السامة للخلايا الخاصة بالمستضد للاختبار الوظيفي في نموذج مرض السكري المناعي الذاتي. J. Vis. Exp. (2019).

يوضح هذا الفيديو تقنية لتوليد الخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري (CAR) الخاصة بالمستضد من خلال نقل الفيروسات القهقرية. تضاف خلايا الفئران CD8 + T المنشطة إلى صفيحة ميكروويل مغطاة بشظايا فيبرونيكتين مؤتلفة. ثم يتم إدخال نواقل الفيروسات القهقرية التي تحتوي على الحمض النووي الريبي المعدل وراثيا الذي يشفر مستقبلات مستضد خيميرية خاصة بالمستضد (CAR) ، ويتم طرد اللوحة لتسهيل التنبيغ. بعد الحضانة ، تعبر الخلايا المنقولة عن CARs الخاصة بالمستضد على سطحها.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. توليد والتحقق من صحة الجسم المضاد Fab أحادي السلسلة (scFab) -CARs.

ملاحظة: تحتوي CARs عادة على 3 مجالات حرجة - مجال استهداف المستضد ، ومجال فاصل / غشاء ، ومجال إشارات السيتوبلازمية. يعتمد التصميم الدقيق لكل CAR على الهدف المقصود ، وبالتالي ، بصرف النظر عن السمات الرئيسية للبناء ذات الصلة بتوليد الفيروس القهقري ، لن يتم وصفه بالتفصيل في هذا البروتوكول. ويبين الشكل 1 التصميم العام لوحدات الاستجابة للسيارات المستخدمة في الدراسات الموضحة أدناه. باختصار ، يشتمل مجال الاستهداف على السلسلة الخفيفة بأكملها والمجال المتغير و CH1 للسلسلة الثقيلة من الجسم المضاد أحادي النسيلة الأصلي المرتبط برابط شبه صلب. مجال المباعد / الغشاء من الماوس CD28 ، ومجال الإشارات عبارة عن اندماج يحتوي على عناصر من الماوس CD28 و CD137 (4-1BB) و CD247 (CD3ζ). يتم تجميع هذه العناصر من خلال إجراءات البيولوجيا الجزيئية القياسية مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل للصق (PCR) ، أو تخليق "كتلة جينية" مناسبة. وترد تفاصيل جيل mAB287 CAR في Zhang et al. يمكن الحصول على تسلسل (كدنا) من المؤلفين عند الطلب.

1. تجميع هيكل CAR
   1. قم بتجميع الجسم المضاد Fab أحادي السلسلة (scFab) ومجالات المباعد / الإشارات المدمجة بشكل منفصل ، واستخدم تقنية ربط "3 نقاط" لتجميع البناء النهائي (الشكل 1).
      ملاحظة: الشرط الرئيسي لإدراج CAR هو أنه يجب أن يحتوي على مواقع نوكلياز داخلي مقيدة مرافقة تسمح بالربط في ناقل التعبير الفيروسي القهقري pMSCV-IRES-GFP II (pMIG II) ، أو مشتق ذي صلة مناسب أيضا.
2. التحقق من صحة التعبير السطحي CAR
   1. قم بنقل خلايا الورم الهجين باستخدام جزيئات الفيروسات القهقرية المشتقة من pMIG II التي تم إنشاؤها بواسطة بروتوكول قياسي (على سبيل المثال ، هولست وآخرون).
   2. قم بتشغيل تحليل قياس التدفق الخلوي للكشف عن التعبير عن GFP من متجه CAR.
   3. التعبير السطحي للبقع ل CAR للأورام الهجينة المنقولة باستخدام الأجسام المضادة المصنفة ضد سلسلة الفأر κ (على سبيل المثال ، استنساخ RMK-45).
3. التحقق من خصوصية CAR
   1. تحفيز خلايا الورم الهجين المنقولة بمستضدات مناسبة مرتبطة بالصفائح أو مستضدات خلوية. بعد الزراعة المشتركة بين عشية وضحاها ، يتم جمع المواد الطافية والسيتوكينات المفرزة ، وفحصها بواسطة مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA).
      ملاحظة: من الناحية المثالية ، يجب التحقق من صحة كل سيارة CAR بشكل مستقل قبل استخدامها للتحويل. في هذه الخطوة ، قد يتم إيقاف التجربة مؤقتا وإعادة تشغيلها لاحقا.

< p class = "jove_title" >2. تعداء الخلايا المنتجة الفيروسية (اليوم - 4 إلى اليوم 3)

ملاحظة: يتم إنتاج الفيروس القهقري باستخدام خلايا Phoenix-ECO (انظر جدول المواد). استخدم الاحتياطات المناسبة لتوليد العوامل التي يحتمل أن تكون معدية (ويفضل أن تكون بما في ذلك خزانة مخصصة للسلامة الحيوية من المستوى 2 (BSL-2) وحاضنة منفصلة لزراعة الخلايا المنقولة / المنقولة).

1. ذوبان خلايا العنقاء (اليوم -4)
   1. قم بإذابة الجليد 2 × 10⁶ خلايا Phoenix-Eco. قم بتوسيع نطاق عدد خلايا Phoenix إذا تم التخطيط لعمليات نقل متعددة.
   2. ضعهم في طبق زراعة أنسجة مقاس 10 سم مع 10 مل من الوسط (وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) الذي يحتوي على 10٪ مصل ربلة الساق الجنينية (FCS)).
2. خلايا ممر فينيكس (اليوم -3)
   1. قم بإزالة الوسط واغسله ب 5 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (DPBS) من Dulbecco.
   2. أضف 3 مل من 0.25٪ التربسين واحتضنه عند 37 درجة مئوية تحت 10٪ من الغلاف الجوي_CO2 لمدة 3 دقائق.
   3. حصاد الخلايا ثم الحبيبات عن طريق الطرد المركزي لمدة 3 دقائق عند 200 × جم. أعد صفيحة الخلايا بوسط طازج 10 مل وتحتضنه عند 37 درجة مئوية.
3. تشعيع خلايا فينيكس (يوم -1 بعد الظهر)
   1. لتقليل المزيد من انقسام الخلايا ، اجمع خلايا Phoenix كما هو موضح في الخطوة 2.2 ، وأعد تعليقها في 5 مل من الوسط ، وقم بإشعاع الخلايا جاما على الجليد (1000 راد).
      ملاحظة: يجب توخي الحذر في الأعمال الإشعاعية لتجنب تعرض الأفراد.
   2. الطرد المركزي للخلايا المشعة ، وإعادة تعليقها في وسط جديد ، ولوحة في 2 × 10⁶ خلايا (في 10 مل من المتوسط) / لوحة / CAR ، واحتضانها.
4. التعداء (اليوم 0 - صباح)
   1. قم بشفط المادة الطافية من خلايا فينيكس ، واغسلها ب 5 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، وأضف بعناية 7 مل من وسط المصل المختزل (على سبيل المثال ، Opti-MEM) بالتنقيط إلى الجدار الجانبي لللوحة لتجنب إزعاج الطبقة الأحادية. نقل الخلايا مرة أخرى إلى الحاضنة.
   2. خذ أنبوبين من البولي بروبلين دائري القاع سعة 14 مل ، وأضف 1.5 مل من وسط المصل المخفض لكل منهما. إلى أنبوب واحد ، أضف 40 ميكرولتر من كاشف التعداء (انظر جدول المواد).
   3. إلى الأنبوب الآخر ، أضف 15 ميكروغرام من Ab-CAR-plasmid (تم إنشاؤه في الخطوة 1) و 5 ميكروغرام من بلازميد المغلف والتغليف (5 ميكروغرام pCL-Eco). احتضان الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
   4. أضف خليط كاشف الإرسال من الخطوة 2.4.2 بالتنقيط إلى الأنبوب الثاني دون ملامسة جوانب الأنبوب ، واخلطه عن طريق سحب المحلول لأعلى ولأسفل برفق 3 مرات. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة على الأقل.
   5. أضف 3 مل من الخليط بالتنقيط إلى خلايا فينيكس ، وضعها في حاضنة زراعة الأنسجة.
   6. بعد 4-5 ساعات أضف 1 مل من FCS. خلايا الزراعة بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية.
5. تغيير متوسط (اليوم 1)
   1. قم بإزالة المادة الطافية التي تحتوي على مجمعات كاشف البلازميد / التعدي والتخلص منها وفقا للإجراءات المؤسسية لمعالجة المواد المعدية. أضف 4 مل من وسط الثقافة الطازج الدافئ مسبقا إلى الخلايا.
6. فيروس الحصاد للتنبيغ (اليوم 2)
   1. اجمع الوسط المحتوي على الفيروس من خلايا فينيكس باستخدام حقنة معقمة ، وقم بالفلتر (0.45 ميكرومتر) لإزالة بقايا الخلايا المتبقية ، وقم بتجميعها في أنبوب جديد.
   2. يضاف مخزون الإنترلوكين البشري المؤتلف (rhIL-2) إلى التركيز النهائي البالغ 200 وحدة دولية (IU) / مل. استخدم الفيروس على الفور للتنبيغ (الخطوة 5.3). أضف 4 مل من الوسط الطازج إلى خلايا فينيكس وضعها في الحاضنة.
7. تكرار جمع الفيروسات (اليوم 3)
   1. كرر الخطوة 2.6 ، لكن تخلص من خلايا Phoenix كنفايات معدية بدلا من إضافة وسيط جديد. يستخدم هذا المادة الطافية في الخطوة 5.4.

< p class = "jove_title" >3. عزل الخلايا التائية CD8 الأولية وتنشيطها (اليوم -1 إلى اليوم 0)

ملاحظة: في السابق ، قم بجمع خلايا CD8 T من إناث الفئران غير المصابة بمرض السكري (NOD) في 4-5 أسابيع ، وهي نقطة زمنية قبل بدء التهاب الجزر. تعامل مع جميع الفئران باتباع البروتوكولات المعتمدة من لجنة رعاية واستخدام المؤسسية (IACUC). يتم إثراء خلايا CD8 T من خلايا الطحال باستخدام مجموعة اختيار سلبية تجارية.

1. ألواح الطلاء بالأجسام المضادة CD3 / CD28 (اليوم -1)
   1. أضف 1 مل من خليط من الأجسام المضادة CD3 و CD28 المضادة للفأر (كلاهما عند 1 ميكروغرام / مل في PBS) إلى كل بئر من صفيحة 24 بئرا ، واحتضانها عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
   2. في اليوم التالي ، اغسل الأطباق ب 1 مل من PBS المعقم 3 مرات قبل إضافة خلايا CD8 T الفئرانية (الخطوة 4.1).
      ملاحظة: سيختلف عدد الآبار التي سيتم طلاؤها لكل تجربة ، اعتمادا على العدد الإجمالي لخلايا CD8 T المنشطة المطلوبة.
2. مجموعة من خلايا الطحال (اليوم 0)
   1. قتل فئران من إناث NOD تتراوح أعمارهن بين 4-5 أسابيع باستخدام استنشاق ثاني أكسيد الكربون₂ متبوعا بقطع الرأس. احصد الطحال وضعه في مصفاة خلوية تنقع في 10 مل PBS في طبق زراعة الخلايا على الجليد.
   2. في غطاء مزرعة الخلية ، قم بتقطيع كل طحال إلى 3-5 قطع ، واضغط على الأنسجة باستخدام مكبس معقم من حقنة 3 أو 5 مل لإجبار شظايا الطحال على الفصل والسماح للخلايا بالمرور عبر الشبكة السلكية.
   3. قم بإزالة خلايا الدم الحمراء برفق عن طريق تعليق خلايا الطحال في مخزن تحلل الخلايا الحمراء المخفف 1: 4 (1 مل من محلول التحلل في 3 مل من PBS للطحال الواحد) ، واحتضانه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   4. بعد ذلك ، قم بتخفيف 10 ميكرولتر من تعليق الخلية بمحلول صبغة تريبان الأزرق لعد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم ، وحبيبات باقي الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 350 × جم لمدة 7 دقائق.
3. إثراء الخلايا التائية CD8 (اليوم 0)
   1. قم بإثراء خلايا CD8 T عن طريق التحديد السلبي باستخدام مجموعة عزل الخلايا التائية CD8 بالماوس ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
      ملاحظة: لضمان نقاء عال ، قم دائما بتقريب أرقام الخلايا عند حساب حجم الجسم المضاد الحيوي المراد إضافته (على سبيل المثال ، استخدم حجم الكواشف المقترح ل 10⁸ خلايا لحساب 9.1 × 10⁷ خلايا).
   2. قم بتعليق كريات الخلايا في 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت و 100 ميكرولتر من كوكتيل البيوتين والأجسام المضادة لكل 1 × 10⁸ خلايا ، واخلطها جيدا واحتضانها لمدة 5 دقائق في الثلاجة (4 درجات مئوية) للسماح بربط الأجسام المضادة.
   3. أضف 300 ميكرولتر من مخزن الملصقات و 200 ميكرولتر من الخرز الدقيق المضاد للبيوتين لكل 1 × 10⁸ خلايا ، واخلطها جيدا واحتضانها لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
   4. أثناء انتظار ربط الخرزة الدقيقة ، قم بإعداد عمود الفصل على الفاصل. اغسل العمود عن طريق الشطف ب 3 مل من المخزن المؤقت لوضع العلامات.
   5. مرر 1000 ميكرولتر من خليط الخرزة / الخلية عبر مصفاة خلية 40 ميكرومتر قبل التحميل على عمود الفصل لإزالة مجاميع الخلايا. اجمع تدفق العمود في أنبوب 15 مل مبرد مسبقا.
   6. اغسل العمود حسب تعليمات الشركة المصنعة ، وجمع كل النفايات السائلة في نفس الأنبوب. حدد رقم الخلية (نفس الخطوة 3.2.4) واجمعها بالطرد المركزي عند 350 × جم لمدة 5 دقائق. اغسل الخلايا عن طريق التعليق في 2 مل من وسط الخلايا التائية الكامل (RPMI-1640 الذي يحتوي على FCS ، 2-mercaptoethanol ، rhIL-2 (200 U / mL) ، إنترلوكين -7 الفأر (mIL-7 ، 0.5 نانوغرام / مل) ، ITS ، 4-(2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبرازينيثان سلفونيك حمض (HEPES) والبنسلين - ستربتومايسين) والطرد المركزي عند 350 × جم لمدة 5 دقائق.
   7. أعد تعليق الخلايا في وسط خلية تائية كاملة مسخنة مسبقا (37 درجة مئوية) بتركيز 0.25-0.5 × 10⁶ / مل.

< p class = "jove_title" >4. تنشيط الخلايا التائية (اليوم 0 إلى 2)

1. أضف 2 مل من تعليق الخلية (0.25-0.5 × 10⁶ / مل) إلى كل بئر مغلف من لوحة 24 بئرا المغلفة بالجسم المضاد CD3 / CD28 من الخطوة 3.1.2. استخدم حركة دوامة لتوزيع الخلايا بالتساوي.
   ملاحظة: أضف الخلايا باستخدام حركة دوامة لتوزيعها بالتساوي وتقليل تأثيرات الحافة. إذا تجمعت الخلايا على طول حافة الآبار ، تقليل معدل التنبيغ وصلاحية الخلية.
2. كعنصر تحكم ، قم بوضع نفس العدد من خلايا CD8 T في بئر واحد غير مطلي من اللوحة. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية باستخدام حاضنة غاز 10٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 48 ساعة < / > ملاحظة: بعد 48 ساعة ، يمكن تأكيد التنشيط باستخدام المجهر. ستكون الخلايا المنشطة أكبر من الخلايا التي لم تواجه أجساما مضادة ل CD3 / CD28.

< p class = "jove_title" >5. نقل خلايا CD8 T المنشطة (الأيام من 1 إلى 3)

ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول طريقة نقل الدوران. مطلوب جهاز طرد مركزي مزود بدوار متأرجح ومحولات لوحة زراعة الأنسجة قادرة على الحفاظ على درجة حرارة داخلية تبلغ 37 درجة مئوية. لضمان أقصى قدر من الكفاءة ، في يوم التنبيغ ، قم بتسخين جهاز الطرد المركزي مسبقا إلى 37 درجة مئوية قبل جمع الفيروس.

1. تحضير الألواح المطلية بشظايا الفيبرونيكتين البشرية (اليوم 1 إلى اليوم 2)
   1. في اليوم الأول ، أضف 0.5 مل من الفيبرونيكتين (50 ميكروغرام / مل في PBS) إلى آبار صفيحة 24 بئرا ، واحتضنها طوال الليل عند 4 درجات مئوية < br / > ملاحظة: عادة ما تكون هناك حاجة إلى بئرين مغطيين بالألياف لكل صفيحة من خلايا فينيكس المنقولة.
   2. في اليوم 2 ، قم بإزالة محلول الفبرونيكتين ، واستبدل ب 1 مل من ألبومين مصل البقر 2٪ (BSA) في PBS. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة "لمنع" مواقع الربط غير المحددة.
   3. اغسل الآبار المعالجة ب 1 مل من PBS المعقم. بعد إزالة محلول الغسيل ، تكون اللوحة جاهزة للاستخدام ؛ أو يمكن إغلاقها وتخزينها عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
2. مجموعة من خلايا CD8 T المنشطة (اليوم 2)
   1. احصد خلايا CD8 T المنشطة ، وعد وحساب صلاحية الخلية باستخدام trypan blue أو أداة آلية مناسبة.
   2. اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وأعد تعليقها عند 5 × 10⁶ خلايا قابلة للحياة / مل للنقل. حافظ على كمية صغيرة من الخلايا في الثقافة في وسط الخلايا التائية الكامل في حاضنة ثاني أكسيد الكربون₂ لتوفير تحكم في فرز الخلايا المنشطة المضان اللاحق للخلايا المنقولة (الخطوة 6).
      ملاحظة: بعد التنشيط لمدة 48 ساعة ، يجب أن يزيد العدد الإجمالي للخلايا بمقدار 1.5 ضعف تقريبا ، وأن تكون قابلية للحياة أكبر من 95٪.
3. التنبيغ (اليوم 2)
   1. أضف 100 ميكرولتر من معلق خلية CD8 المنشط لكل بئر (0.5 × 10⁶ خلايا) إلى الصفيحة المطلية بالفبرونيكتين. ثم أضف 1.5-2 مل من الوسط المحتوي على الفيروسات (من الخطوة 2.6) إلى كل بئر. امزج باستخدام حركة دوامة لتوزيع الخلايا بالتساوي (الشكل 2).
   2. ضع اللوحة في كيس بلاستيكي بسحاب وختم (لتوفير احتواء ثانوي). جهاز طرد مركزي عند 2000 × جم لمدة 90 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
   3. قم بإزالة اللوحة من جهاز الطرد المركزي. في السلامة البيولوجية ، تقوم الخزانة بإزالة الكيس البلاستيكي بعناية والتأكد من أن الجزء الخارجي من اللوحة غير ملوث بأي وسيط.
   4. ثم انقل اللوحة إلى حاضنة CO₂ المخصصة 37 درجة مئوية. بعد 4 ساعات ، قم بإزالة 1 مل من الوسط من كل بئر واستبدلها ب 1 مل من وسط الخلايا التائية الكاملة الدافئة مسبقا. استبدل اللوحة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون₂.
      ملاحظة: تعامل مع جميع الوسائط من الخلايا المنقولة كنفايات معدية.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: تخطيطي لبناء الفيروسات القهقرية CAR. يشتمل CAR على مجال استهداف مشتق من جزء Fab لجسم مضاد أحادي النسيلة مناسب للفأر ، ومجال فاصل / مرساة غشائية / إشارات من الفأر CD28 و CD137 و CD247. يتم إدخال (كدنا) الاصطناعي في ناقل التعبير الفيروسي القهقري pMIG-II. يتم عرض مواقع نوكلياز التقييد المستخدمة لتوليد mAb287-CAR.

< p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" &...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 2-ميركابتو إيثانول (50 ملم) جيبكو 21985-023 50 ميكرومتر 5 'سباق PCR كلونتك 634859 الأجسام المضادة CD28 المضادة للفأر العلوم البيولوجية الإلكترونية 14-0281-86 التركيز النهائي عند 1 ميكروغرام / مل الجسم المضاد CD3e المضاد للفأر العلوم البيولوجية الإلكترونية 145-2 ج 11 التركيز النهائي عند 1 ميكروغرام / مل البيوتين الفئران المضادة للفأر IFN-γ BD Biosciences 554410 تركيز العمل عند 0.5 ميكروغرام / مل جيش صرب البوسنه سيغما أ 7030 مجموعة Maxi-Prep الخالية من Endo كياجين هاتف 12362 الجنتاميسين جيبكو 15750-060 النهائي 50 ميكروغرام / مل. FCS معطل بالحرارة هيكلون SH30087.03 نهائي 10٪ FCS الهبس (100X) جيبكو هاتف: 15630-080 1 مرة الأنسولين - ترانسفيرين - السيلينيوم - الإيثانولامين (ITS 100x) ثيرموفيشر 51500056 التركيز النهائي هو 1x ليبوفيكتامين 2000 إنفيتروجين 11668019 أعمدة LS ميلتيني بيوتيك 130-042-401 المخزن المؤقت لفصل MACS ميلتيني بيوتيك 130-091-221 طقم عزل الخلايا التائية CD8a + T شركة ميليتيني بيوتيك 130-104-075 طقم عزل الخلايا التائية CD8a + T ميلتيني بيوتيك 130-104-075 Opti-MEM متوسط ثيرموفيشر 31985070 البنسلين ستربتومايسين (5000 وحدة / مل) ثيرموفيشر 15070063 50 وحدة / مل خلايا Phoenix-ECO ATCC [رل-3214] محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) جيبكو 10010-023 pMIG II أدجين 52107 PMSCV-IRES-GFP II أدجين 52107 عازلة تحلل الخلايا الحمراء سيغما R7767 ريترو نيكتين تاكارا تي 100 أ تركيز العمل عند 50 ميكروغرام / مل في PBS rhIL-2 (تركيز المخزون 105 وحدة دولية / لتر) بيبروتك 200-02 التركيز النهائي عند 200 وحدة دولية / مل rmIL-7 (تركيز المخزون 50ng / ul) البحث والتطوير 407-مل-005 التركيز النهائي عند 0.5 نانوغرام / مل RPMI-1640 جيبكو 11875-093 مصافي الخلايا المعقمة فيشر ساينتيك 22-363-548 تريبل جيبكو 12605-028