علاج العاثيات ضد عدوى الزائفة الزنجارية في أجنة أسماك الزرد

الملخص

المصدر: Cafora ، M. ، et al. ، A. تطبيق العلاج بالعاثيات لمواجهة عدوى الزائفة الزنجارية في أجنة أسماك الزرد التليف الكيسي. J. Vis. Exp. (2020)

يوضح الفيديو تقنية العلاج بالعاثيات التي تستهدف عدوى الزائفة الزنجارية في أجنة أسماك الزرد التليفية الكيسية. يقلل العلاج بالعاثيات بشكل فعال من الحمل البكتيري ويخفف من الاستجابات المناعية المسببة للالتهابات في أجنة أسماك الزرد التليفية الكيسي المصابة بالبكتيريا ، مما يؤدي إلى تقليل فتك جنين التليف الكيسي.

البروتوكول

فئة < ص = "jove_title" >1. الحقن المجهري لأجنة أسماك الزرد بالبكتيريا وكوكتيل العاثيات

ملاحظة: لإجراء عدوى جهازية ، يجب أن يكون للجنين دورة دموية تبدأ عادة بعد 26 hpf.

1. بعد 26 HPF ، أعدت الأجنة dechorionate بمحلول بروناز عن طريق إذابة مسحوق البروناز في وسط E3 بتركيز 2 مجم / مل. ماصة الأجنة برفق لكسر المشيمة. تخلص من وسط البروناز / E3 واشطف الطبق عدة مرات باستخدام E3 الطازج لإزالة كل البروناز.
2. تخدير أجنة الزرد في وسط E3 يحتوي على التريكايين قبل 5 دقائق تقريبا من الحقن.
3. قم بعرض الأجنة المخدرة في المسار المعد في الخطوة 1. استخدم طرف تحميل هلام ناعم لبطانة الأجنة في الوضع الجانبي.
4. قم بتحميل إبرة الحقن المجهري بحوالي 5 ميكرولتر من مستحضر المتصورة الزنجارية.
5. أدخل الإبرة ظهريا إلى نقطة البداية لقناة Cuvier حيث تبدأ في الانتشار فوق كيس الصفار. قم بحقن حجم 1-3 نانولتر وتأكد من أن الحجم يتوسع مباشرة داخل القناة ويدخل في الدورة الدموية.
6. بعد كل 50 جنينا محقونا تقريبا ، قم بحقن قطرة من البكتيريا في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل مع 100 ميكرولتر من PBS المعقم للتحقق مما إذا كان حجم الحقن لا يزال كما هو. قم بوضع اللقاح على LB أجار (انظر الجدول 1) عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها لتقييم CFU.
7. انقل الأجنة المحقونة في طبقين نظيفين من بتري مع متوسط E3 طازج + PTU (الجدول 1) واحتضانها عند 28 درجة مئوية.
8. في نقطتين زمنيتين محددتين: بعد 30 دقيقة أو 3 ساعات من الحقن البكتيري ، أخرج أحد أطباق بتري مع الأجنة المحقونة بالبكتيريا من الحاضنة وقم بمحاذاة المسار كما هو موضح في 6.3 لحقن كوكتيل العاثية.
9. قم بتحميل إبرة الحقن المجهري بحوالي 5 ميكرولتر من كوكتيل العاثيات (مزيج من أربعة عاثيات تصيب السلالة PAO1) بطرف تحميل هلام ناعم وقم بتثبيته في الحاقن الدقيق.
10. حقن كوكتيل العاثيات في قناة كوفييه من الأجنة التي تم حقنها مسبقا بالبكتيريا.
11. انقل الأجنة المحقونة الدقيقة في طبقين نظيفين من بتري مع E3 متوسط طازج + PTU واحتضانها عند 28 درجة مئوية.

الجدول 1: إعداد الحلول

محاليل اعداد محلول مخزون التخدير 25X 4 مجم / مل من التريكايين في H2O المقطر. حل عمل مخدر 1X يخفف في H2O المقطر محلول مخزون التريكايين 25X تحضير للوصول إلى تركيز 1X (0.16 مجم / مل) Tricaine من H2O المقطر. CsCl د = 1.3 20.49 جم في 50 مل TN CsCl د = 1.4 20.28 جم في 50 مل TN CsCl د = 1.5 34.13 جم في 50 مل TN CsCl د = 1.6 41.2 جم في 50 مل من TN E3 الجنين الوسط لجنين الزرد 1 لتر 1 من E3 (خفف مخزون 50X ب H2O المقطر) + 200 ميكرولتر من 0.05٪ أزرق ميثيل . تخزين في RT. محلول مخزون متوسط الجنين E3 (50X) 73.0 جم كلوريد الصوديوم ، 3.15 جم كلوريد كلوريد ، 9.15 جم كلوريد الكالسيوم 2 ، و 9.95 جم كلوريد الكلوريد 4 في 5 لتر من H2O المقطر. تخزين في RT. أجار LB 10 جم / لتر من التربتون ، 5 جم / لتر من مستخلص الخميرة ، 5 جم / لتر كلوريد الصوديوم ، 10 جم / لتر أجار مرق LB ل 1 لتر: 950 مل H2O ، 10 جم التربتون ، 10 جم كلوريد الصوديوم ، 5 جم مستخلص الخميرة PBST برنامج تلفزيوني 1X + تريتون × 1٪ الحل الفسيولوجي 0.9٪ كلوريد الصوديوم محلول مخزون حجب التصبغ 10X 0.3 مجم / مل من مسحوق فينيل ثيوريا (PTU) في وسط الجنين E3 لجنين الزرد حل مخزون Pronase 5X 5 مجم / مل مسحوق بروناز في وسط جنين E3 لجنين الزرد المخزن المؤقت TN 10 ملي مولار تريس حمض الهيدروكلوريك 8.0 ، 150 ملي كلوريد الصوديوم

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات باكتو أجار دينار بحريني هاتف: 214010 Dulbecco محلول ملحي مخزن مخزن PBS سيجما ألدريتش د8537 إيثيل 3-أمينوبنزوات ميثان سولفونات سيجما ألدريتش 886-86-2 الاسم الشائع tricaine Femtojet Micromanipulator إيبندورف 5247 إبر الحقن المجهري جهاز هارفارد N-Phenylthiourea > = 98٪ ألدريتش - P7629 103-85-5 بروناز سيجما ألدريتش 9036-06-0 Z-MOLDS الحقن المجهري أدوات الدقة للكلمات