حقن بلازما غنية بالصفائح الدموية في وتر العرقوب المقسم للفئران

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Greimers، L.، et al. تأثيرات البلازما الغنية بالصفائح الدموية الخيفية (PRP) على عملية الشفاء من أوتار العرقوب المقطعة للفئران: وصف منهجي. J. Vis. إكسب. (2018).

يوضح هذا الفيديو تقنية لحقن البلازما الغنية بالصفائح الدموية (PRP) في وتر العرقوب المقسم للفئران. يتم استئصال جزء صغير من وتر العرقوب للفأر المتلقي ، ويتم خياطة الموقع ، ويسمح للفأر بالتعافي. في الوقت نفسه ، يتم جمع الدم الكامل من فأر متبرع وطرده للحصول على البلازما الغنية بالصفائح الدموية ، والتي يتم تنشيطها بعد ذلك وحقنها في الموقع المخيط للفأر المتلقي للحث على إصلاح الأوتار.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< ص الفئة = "jove_title" >1. تحضير

1. استخدم 132 فأرة Sprague-Dawley البالغة من العمر شهرين تزن 320-450 جراما (120 فأرا للتجريب و 12 فأرا لأخذ عينات الدم ، الشكل 1). كان خمسة عشر فأرا لكل مجموعة كافيا للحصول على قوة 0.8 (فرصة 80٪ لإيجاد دلالة إحصائية إذا كان التأثير المحدد موجودا).
2. ضع جميع الفئران في أقفاص كلاسيكية تحت ظروف عزل في منشأة تقليدية مجهزة بمحطة تغيير الملابس. التحريض على التكاثر في رف IVC (قفص جيد التهوية بشكل فردي) ، مع شراء الفئران SPF (خالية من مسببات الأمراض) على وجه التحديد.
3. استخدم ظروف السكن التالية: تتراوح درجة الحرارة من 19-24 درجة مئوية ؛ الرطوبة النسبية: 40-60٪ ؛ التهوية: تكرار تجديد الهواء: 10-15 في الساعة ؛ دورة الضوء / الظلام: 12 ساعة - 12 ساعة.
4. تعقيم جميع معدات الأقفاص واستخدام الفراش المشعع. قم بتنفيذ تخصيب الأقفاص بشكل منهجي عن طريق وضع صواني ومناشف من الورق المقوى المعقمة داخل الأقفاص.
5. السماح بالوصول إلى المنطقة في ظل ظروف مقيدة: معطف مختبر جديد ، وقناع ، وقفازات ، وأحذية ، وغطاء شعر عند المدخل.
6. إجراء مراقبة صحة المستعمرة على الخافرة الموجودة على فراش متسخ سنويا ، وفقا لتوصيات Felasa للمرافق التقليدية. احتفظ بأربعة إلى خمسة لكل قفص مع النظام الغذائي الإشعاعي المناسب وتوفير المياه المحمضة بشكل مجاني. راقب يوميا.
7. نقل الفئران المختارة للتدخل الجراحي في تصفية الأقفاص العلوية إلى غرف الجراحة قبل ساعتين من الجراحة.

< p class = "jove_title" >2. الإجراء الجراحي

1. تحضير الأدوات الجراحية: مقص ناعم ، ومشبك ، ومشبكين مرقئين ، وحامل إبرة. أثناء جميع الإجراءات ، ارتد قفازات وقناعا وغطاء رأس ومعطف مختبر.
2. قسم الفئران بشكل عشوائي إلى مجموعتين (البلازما الغنية بالصفائح الدموية والمحلول الملحي).
3. أخرج الجرذ من قفصه ووزنه. استخدم علامات الأذن المرقمة للتعرف على الفئران. لتجنب جفاف العينين ، ضع قطرات الماء على القرنية.
4. تخدير الفئران داخل الصفاق باستخدام زيلازين (10 ملغ/كغ من وزن الجسم) والكيتامين (80 ملغ/كغ من وزن الجسم). ضع تحت مراقبة القلب والجهاز التنفسي لتأكيد التخدير والتحقق من ردود أفعال العين.
5. حقن 50 ميكرولتر من البوبرينورفين تحت الجلد (0.01-0.05 مجم / كجم كل 8-12 ساعة) في منطقة الرقبة كمسكن للألم.
6. احلق الطرف الخلفي الأيسر باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية ، وقم بتطهيره ب 3 مقشرات متناوبة من محلول إيزو بيتادين / كحول (مخفف بنسبة 1:10) ، وضع الجرذ على وسادة دافئة (20 درجة مئوية) تحت مجهر تشريح. ضع الجرذ على الاستلقاء الجانبي مع الساق المراد تشغيلها في وضع متفوق. امسك المخلب بالملقط الجراحي.
7. باستخدام المقص ، قم بعمل شق جانبي صغير (20-25 مم) في الجلد المحيط بوتر العرقوب الأيسر ، وقم بتشريح اللفافة باستخدام مقص ناعم لفضح مركب وتر العرقوب (الشكل 2 أ).
8. قم بإزالة وتر أخمص الجبل بالمقص (الشكل 2 ب).
9. اقطع وتر العرقوب بشكل عرضي 5 مم بالقرب من إدخاله العقبي وقم بإزالة جزء بطول 5 مم باستخدام المقص. لا تخيط الوتر (الشكل 2 ج ، 2 د).
10. خياطة اللفافة والجلد بخيوط قابلة للامتصاص ، والقيام بخياطة نفاثة (خياطة مستمرة). يمكن أن تمنع خيوط الشعيرات الأحادية أيضا فتل الجلد إلى الشق الجراحي.
11. ضع الجرذ تحت مصباح التدفئة حتى يستيقظ ، ثم ضع الجرذ مرة أخرى في قفص (58 × 38 سم) (ملاحظة: لا يتم فرض الشلل).

فئة

3. إعداد PRP

1. تخدير الفئران المانحة بالزيلازين (10 ملغ/كغ من وزن الجسم) والكيتامين (80 ملغ/كغ من وزن الجسم) عن طريق الحقن داخل الصفاق. يتم إجراء حقن البلازما الغنية بالصفائح الدموية بعد ساعتين من الجراحة دون أي إعادة تخدير.
2. حقن 50 ميكرولتر من البوبرينورفين تحت الجلد كمسكن للألم.
3. جمع الدم الكامل (20 مل لكل فأر ، نزيف نهائي) عن طريق ثقب القلب في أنابيب معقمة تحتوي على 3.2٪ سترات الصوديوم المخزنة (0.109 م ، مضاد للتخثر). ثم ، قتل الفئران عن طريق الحقن داخل القلب.
4. للحصول على البلازما الغنية بالصفائح الدموية ، قم بالطرد المركزي للدم لمدة 10 دقائق عند 150 × جم ودرجة حرارة الغرفة. تنتج خطوة الطرد المركزي الأولية منخفضة السرعة مرحلتين متميزتين: مرحلة سفلية تتكون من خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) التي تمثل حوالي 80-90٪ من الحجم الكلي والمرحلة العليا المكونة من البلازما الغنية بالصفائح الدموية (PRP) (عادة 10-20٪ من عينة الدم).
5. اجمع PRP (المرحلة العليا) في أنبوب بلاستيكي ثانوي باستخدام ماصة نقل البلاستيك. نظرا لأن الواجهة بين البلازما الغنية بالصفائح الدموية وخلايا الدم الحمراء فضفاضة جدا ، فلا تقم بسحب الماصة بالقرب من الواجهة. عند التعامل معها بشكل صحيح ، يجب أن تكون كرات الدم الحمراء الملوثة في البلازما الغنية بالصفائح الدموية أقل من 0.05 × 10³ خلايا / ميكرولتر ، وتخلص من المرحلة السفلية المتبقية وأنبوب تجميع الدم الأولي.
6. حدد حجم البلازما الغنية بالصفائح الدموية التي تم جمعها وقياس عدد الصفائح الدموية على محلل أمراض الدم. هذه القيم مطلوبة للحسابات لضبط تركيز الصفائح الدموية في الخطوة التالية. يعد تعداد خلايا الدم مفيدا أيضا في تقييم التلوث المحتمل بكرات الدم الحمراء وكرات الدم البيضاء. عادة ما يكون تركيز الصفائح الدموية في البلازما الغنية بالصفائح الدموية في هذه المرحلة 1 - 1.5 × 10⁶ / ميكرولتر.
7. قم بإجراء طرد مركزي ثان للبلازما الغنية بالصفائح الدموية لمدة 10 دقائق عند 1,000 × جم ودرجة حرارة الغرفة. تنتج خطوة الطرد المركزي عالية السرعة هذه حبيبات صفائح دموية فضفاضة ومادة طافية من البلازما الفقيرة بالصفائح الدموية الذاتية (PPP). باستخدام القيم المحددة في الخطوة 3.6 ، احسب حجم المادة الطافية المراد التخلص منها لتركيز البلازما الغنية بالصفائح الدموية والوصول إلى تركيز نهائي يبلغ 2.5 × 10⁶ / ميكرولتر.
8. اجمع المادة الطافية (PPP) برفق في أنبوب بلاستيكي ثانوي باستخدام ماصة نقل البلاستيك ، مع ترك حوالي ثلثي الحجم النهائي المحسوب في الخطوة 3.7. نظرا لأن الحبيبات فضفاضة ، يتم فقد كمية كبيرة من الصفائح الدموية عند التخلص من PPP ، مما قد يقلل من التركيز المطلوب.
9. أعد تعليق حبيبات الصفائح الدموية بعناية مع المادة الطافية المتبقية عن طريق سحب العينة المتكرر اللطيف. قم بقياس عدد الصفائح الدموية على هذا البلازما الغنية بالصفائح الدموية المركزة. إذا لزم الأمر ، أضف الحجم المناسب من PPP الذاتي للوصول إلى التركيز المستهدف النهائي.
   ملاحظه: استخدم البلازما الغنية بالصفائح الدموية في غضون 3 ساعات من التحضير.
10. أضف 50 ميكرولتر من CaCl₂ (11 مكافئ 10 مل) لكل مل من PRP لتنشيط الصفائح الدموية.
11. حقن 50 ميكرولتر من البلازما الغنية بالصفائح الدموية الطازجة أو المحلول الملحي بإبرة 21G مباشرة في موقع العملية المخيط بعد حوالي ساعة واحدة من التحضير. خلال هذا الوقت ، احتفظ بالبلازما الغنية بالصفائح الدموية في درجة حرارة الغرفة.
12. مراقبة التعافي الوظيفي للفئران عن كثب خلال الأيام التي تلي الجراحة وقبل إزالة وتر العرقوب.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: التصميم التجريبي للدراسة.

< p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 2: إجراء جراحي. < p class = "jove_content" > (أ) مجمع الأوتار بعد إزالة اللفافة المحيطة. < p class = "jove_content" > (ب) إزالة وتر الأخمص. &l...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات زيلازين (Xyl-M) VMD اي مخدر الكيتامين (جيتامين 1000 سيفا) سيفا سانتي أنيمال اي مخدر بوبرينورفين (Vetergésic Multidosis) ألستو اي مسكن إيزو بيتادين ميدا فارما اي مطهر خيوط قابلة للامتصاص فيكريل 6/0 جونسون آند جونسون نيمبوتال سيفا سانتي أنيمال اي مخدر بارافورمالدهيد سيجما ألدريتش ص 6148 يحافظ على بنية الأنسجة الأيزوبروبانول 100٪ VWR 2,09,22,364 الإيثانول 95٪ VWR 2,08,23,362 الزيلين VWR هاتف: 28973.363 بارافين VWR LEIC3950.1006 الهيماتوكسيلين ميليبور 1.15938.0025 تلوين إيوسين ميليبور 1.15935.0100 تلوين يوكيت سيجما ألدريتش 3989 تصاعد متوسط كلوريد_{الهواء 2}