صياغة الجسيمات النانوية المحملة بالحمض النووي الريبي المرسال لأغراض التطعيم

الملخص

المصدر: Fornaguera، C. et al.، توليف وتوصيف الجسيمات النانوية Poly (بيتا أمينويسترز) المحملة بالحمض النووي الريبي المرسال لأغراض التطعيم.J. Vis. Exp. (2021)

يوضح هذا الفيديو طريقة لتوليد لقاح mRNA مرشح باستخدام الجسيمات النانوية البوليمرية. يتفاعل البوليمر الكاتيوني مع mRNA سالب الشحنة ، مكونا تعدد الإرسال. يؤدي تكوين polyplexes إلى استقرار mRNA ، مما يجعله مرشحا محتملا للقاحات mRNA المستقبلية في تطبيقات العلاج المناعي.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تخليق بولي (استرات بيتا أمينو) (pBAE) بوليمر مع قليل الببتيدات الطرفية (OM-pBAE)

1. بلمرة C6-pBAE
   1. أضف 5-أمينو-1-بنتانول (38 مليمول ؛ ميغاواط = 103.16 د) 1-هيكسيل أمين (38 مليمول ؛ ميغاواط = 101.19 دلار) في قارورة زجاجية مستديرة القاع (100 مل). ثم أضف 1،4-بوتانيديول دياكريلات (82 مليمول ؛ ميغاواط = 198.22 د).
   2. قم بتسخين حمام زيت السيليكون مسبقا عند 90 درجة مئوية ، ضع القارورة المستديرة القاع في حمام الزيت وحرك الخليط بمساعدة شريط التحريك المغناطيسي طوال الليل (~ 18 ساعة). بعد ذلك ، خذ المنتج من القارورة المستديرة السفلية وضعها في الفريزر على حرارة -20 درجة مئوية.
      ملاحظه: المنتج على شكل مسحوق لزج ويتم إخراجه من القارورة بمساعدة ملعقة. من الضروري التحقق من صحة بنية البوليمر الذي تم الحصول عليه من خلال ¹H-NMR. تم تسجيل أطياف الرنين المغناطيسي النووي في جهاز 400 ميجاهرتز (انظر جدول المواد) باستخدام الكلوروفورم-d و D₂O كمذيبات. تم أخذ حوالي 10 مجم من كل بولي (β أمينو إستر) وإذابتها في 1 مل من المذيب المنزع.
2. التفاعل مع الببتيدات للحصول على OM-pBAE
   1. أضف 25 مل من 0.1 مل حمض الهيدروكلوريك إلى الببتيدات المختارة ، على سبيل المثال ، الببتيد Cys-His-His-His مع حمض ثلاثي فلورو أسيتيك (TFA ، 200 مجم) ، في أنبوب طرد مركزي وزنه مسبقا 50 مل يمكنه الوقوف على التجفيف بالتجميد والتقليب يدويا طوال الليل للحصول على محلول واضح.
   2. قم بتجميد المحلول عند -80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة وجفف الببتيد الناتج هيدروكلوريد بالتجميد.
      ملاحظة: تحقق مما إذا كان الوزن النهائي يتوافق مع القيمة النظرية.
   3. اصنع محلول C6-pBAE (0.031 مليمول) في ثنائي ميثيل سلفوكسيد. أيضا ، اصنع محلولا من الببتيد هيدروكلوريد (0.078 ملليمول) في ثنائي ميثيل سلفوكسيد.
   4. امزج المحاللين في أنبوب غطاء لولبي وقم بربط الغطاء. قلب محلول الخليط في حمام مائي بدرجة حرارة مضبوطة تبلغ 25 درجة مئوية لمدة 20 ساعة باستخدام قضيب تقليب مغناطيسي.
   5. أضف الخليط إلى 7: 3 (حجم / حجم) ثنائي إيثيل الأثير / الأسيتون. جهاز الطرد المركزي التعليق الناتج عند 25,000 × جم عند 4 درجات مئوية لإزالة المذيب. بعد ذلك ، اغسل المادة الصلبة ب 7: 3 (v / v) ثنائي إيثيل الأثير / الأسيتون مرتين. ثم جفف المنتج تحت فراغ (<0.2 ضغط جوي).
   6. اصنع محلول 100 مجم / مل من المنتج في ثنائي ميثيل سلفوكسيد. المنتج الناتج يسمى C6-peptide-pBAE. من الضروري التحقق من صحة بنية البوليمر الذي تم الحصول عليه من خلال ¹H-NMR لتأكيد اختفاء إشارات الأولفين المرتبطة بالأكريلات الطرفية. إذا لم يتم استخدامه ، يمكن تجميد البوليمر عند -20 درجة مئوية.

< p class = "jove_title" >2. تشكيل Polyplexes

ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الإجراءات داخل غرفة مكيفة للحفاظ على درجة حرارة ثابتة.

1. قم بإذابة البوليمرات C6-peptide-pBAE ودوامة المحلول.
2. ماصة البوليمر تخلط لأعلى ولأسفل وإعداد محلول 12.5 ملي مولار (V₁) في أسيتات الصوديوم (NaAc). ثم قم بتدوير الخليط وانتظر لمدة 10 دقائق.
3. تحضير الحمض النووي الريبي المرسال (mRNA) عند 0.5 مجم / مل واخلطه عن طريق سحب العينة (V₂).
   ملاحظه: من الأهمية بمكان تجنب دوامة الرنا المرسال.
4. دوامة خليط البوليمر عند التركيز النهائي لتحقيق محلول متجانس بين مخزون البوليمر في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ومخزن الأسيتات. < / > ملاحظه: يعتمد تركيز البوليمر النهائي على نسبة N / P (مجموعات النيتروجين إلى الفوسفات) المختارة. تعتمد نسبة N / P على كل mRNA محدد يتم استخدامه. لتغليف البروتين الفلوري الأخضر المعزز (eGFP) ، على سبيل المثال ، تم استخدام نسبة 25: 1 ، كما تم الإبلاغ عنه سابقا.
5. امزج محلول المادة الوراثية ومحلول C6-peptidepBAE (25x من تركيز mRNA) بنسبة 1: 1 (V_i = V₁ + V₂).
   ملاحظه: يتم تحميل C6-peptide-pBAE في أنبوب طرد مركزي دقيق حيث يتم إضافة mRNA عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل للخلط. بمجرد تحضيرها ، يتم تخفيف تركيزات polyplex والحمض النووي و C6-peptide-pBAE نصف.
6. احتضن عند 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في كتلة حرارية. قم بترسيب الماء الخالي من 1: 2 RNase عن طريق إضافة العينة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق محمل مسبقا بالماء.
7. قم بتضمين السوااغ. أضف نفس حجم خليط mRNA و pBAE (V_i) في 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) 20 ملي مولار والسكروز 4٪ عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل. في هذه المرحلة ، تم تخفيف العينة 3x.

< p class = "jove_title" >3. تعدد الطبقات

1. على الفور ، قم بالتجميد عند -80 درجة مئوية من محلول البوليبلكس السابق لمدة 1 ساعة.
2. قم بإجراء التجفيف الأولي باتباع الخطوات: (1) 1 ساعة عند -60 درجة مئوية و 0.001 هيكتوباسكال ؛ (2) 1 ساعة عند -40 درجة مئوية و 0.0001 هيكتوباسكال ؛ (3) 4 ساعات عند -20 درجة مئوية و 0.0001 هيكتوباسكال ؛ (4) 12 ساعة عند 5 درجات مئوية و 0.0001 هيكتوباسكال.
3. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية على الفور لتجنب الجفاف حتى الاستخدام.

المواد