تنقية الجسيمات النانوية البروتينية ذاتية التجميع باستخدام كروماتوغرافيا التقارب

الملخص

المصدر: Karch، C.P. et al.، إنتاج جسيمات البروتين ذاتية التجميع المعبر عنها بالإشريكية القولونية للقاحات التي تتطلب عرضا للحاتمة الثلاثية.J. Vis. Exp. (2019)

يعرض هذا الفيديو تنقية الجسيمات النانوية البروتينية ذاتية التجميع أو SAPNs التي تحمل علامة الهيستيدين باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة المتقاربة. تعتبر أجزاء SAPN المنقاة الناتجة مناسبة لتطوير اللقاح ، مما يبشر بتطبيقات العلاج المناعي المحتملة.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. التعبير عن قلب الجسيمات النانوية البروتينية ذاتية التجميع التي تحتوي على بروتين من ستة حلزون (SHB-SAPN) في بكتريا قولونية BL21 (DE3)

1. امزج 95 مل من المكون A و 5 مل من المكون B من الوسائط في قارورة Erlenmeyer زجاجية معقمة سعة 2 لتر وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد). أضف الأمبيسلين إلى التركيز النهائي البالغ 100 ميكروغرام/مل.
2. تلقيح الوسائط بالإشريكية القولونية من ثقافة مخزون الجلسرين التي تم إنشاؤها مسبقا. احتضان الثقافة عند 30 درجة مئوية مع الرج عند 200 دورة في الدقيقة (دورة في الدقيقة) لمدة 48 ساعة < / > ملاحظة: يحتوي مخزون الإشريكية القولونية BL21 (DE3) المستخدم على ناقل التعبير المقاوم للأمبيسلين مع جين SHB-SAPN. على الرغم من أن البروتوكول العام لوسائل الإعلام يوصي ب 24 ساعة من الحضانة عند 37 درجة مئوية ، إلا أن 48 ساعة من الحضانة عند 30 درجة مئوية تعطي عائدا أعلى ل SHB-SAPN.
3. انقل المزرعة إلى أنبوبين مخروطيين سعة 50 مل. قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 4,000 × جم لمدة 10 دقائق باستخدام دوار بزاوية ثابتة عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية وحفظ الحبيبات لحصاد الخلايا.
   ملاحظة: يمكن معالجة حبيبات الخلية على الفور أو تجميدها عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

< p class = "jove_title" >2. تحلل الإشريكية القولونية BL21 (DE3) عن طريق الصوتنة

< p class = "jove_content" >ملاحظة: استخدم الأواني البلاستيكية والأواني الزجاجية غير النارية المخبوزة على حرارة 250 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل. TCEP ضروري للمخازن المؤقتة أثناء هذا البروتوكول إذا كان المستضد المعروض يحتوي على روابط S-S. بالنسبة لنواة SHB-SAPN فقط ، فإن وجود TCEP في المخازن المؤقتة ليس ضروريا.

1. قم بإعداد عازلة خالية من الإيميدازول (8 M Urea ، 50 mM فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة ، 20 ملي من قاعدة Tris ، 5 ملي مولار TCEP) درجة الحموضة 8.0 (معدلة ب 5 N هيدروكسيد الصوديوم ، هيدروكسيد الصوديوم) وقم بتصفيتها باستخدام وحدة ترشيح زجاجة مفرغة 0.22 ميكرومتر.
2. أعد تعليق الخلايا المحببة (من الخطوة 1.3) بسعة 40 مل من المخزن المؤقت الخالي من الإيميدازول في أنبوب مخروطي واحد سعة 50 مل. صوتنة الخلايا المعلقة مع مسبار على الجليد لمدة 5 دقائق (4 ثوان من الصوتنة ، 6 ثوان من الراحة) مع ناتج صوتنة من 150 واط.
3. جهاز الطرد المركزي للمحللات الخلوية (40 مل) عند 29,000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 25 دقيقة في دوار بزاوية ثابتة لتوليد مادة طافية موضحة. انقل المادة الطافية إلى قارورة معقمة سعة 150 مل وتخلص من الحبيبات. قم بتخفيف المادة الطافية إلى 100 مل باستخدام المخزن المؤقت الخالي من الإيميدازول (يشار إليه لاحقا في البروتوكول باسم "العينة").
   ملاحظة: هناك حاجة إلى خطوة التخفيف هذه لمنع ضغط نظام الكروماتوغرافيا السائلة سريعة الأداء (FPLC) من أن يصبح مرتفعا جدا أثناء تحميل المحللة على العمود.

< p class = "jove_title" >3. تنقية البروتين باستخدام عموده

ملاحظة: تم تنفيذ هذا البروتوكول باستخدام أداة FPLC ، ولكن يمكن تكييفه مع تدفق الجاذبية.

1. قم بإعداد المخازن المؤقتة التالية وقم بتصفيتها باستخدام وحدة ترشيح الزجاجة المفرغة 0.22 ميكرومتر: (1) المخزن المؤقت الخالي من الإيميدازول "Buffer A" (8 M Urea ، 50 mM فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة ، 20 ملي مولار قاعدة تريس ، 5 ملي مولار TCEP) درجة الحموضة 8.0 ؛ '2' 500 ملي مولار إيميدازول عازل "العازلة B" (8 مليونات يوريا، 50 ملي مولار فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة، 20 ملي مولار قاعدة تريس، 5 ملي مولار TCEP، 500 ملي إيميدازول) الرقم الهيدروجيني 8.0؛ و (ثالثا) غسل الأيزوبروبانول (20 ملي تريس ، 60٪ إيزوبروبانول) درجة الحموضة 8.0.< / > ملاحظة: تم ضبط الأس الهيدروجيني لكل مخزن مؤقت باستخدام 5 نيوتن هيدروكسيد الصوديوم.
2. موازنة عموده الخاص به.
   ملاحظة: بالنسبة للإنتاج على نطاق المختبر ، يستخدم هذا البروتوكول عمودا معبأا مسبقا سعة 5 مل ، ولكن يمكن استخدام أي عمود أكبر حجما.
   1. افتح برنامج FPLC وانقر على خيار طريقة جديدة. سيتم فتحه على الفور على قائمة إعدادات الطريقة. ضمن القائمة المنسدلة لموضع العمود ، اختر C1 المنفذ 3.
   2. في القائمة المنسدلة يظهر حسب التقنية ، اختر التقارب. في القائمة المنسدلة نوع العمود ، اختر الآخرين ، Histrap HP ، 5 مل. سيتم ضبط حجم العمود وصناديق الضغط تلقائيا على القيم المناسبة.
   3. انقر فوق الزر "مخطط الطريقة". اسحب الأزرار التالية من القائمة المنبثقة مكتبة المرحلة: التوازن ، ونموذج التطبيق ، وغسل العمود ، والشطف بجوار السهم بهذا الترتيب الدقيق. أغلق قائمة مكتبة المرحلة.
   4. انقر فوق زر التوازن. يجب أن تكون القيم المدرجة في الجدول "المخزن المؤقت الأولي B" (4٪) و "المخزن المؤقت النهائي B" (4٪) و "الحجم (CV)" 5.
   5. انقر فوق مربع نموذج التطبيق. في مربع تحميل العينة ، انقر فوق زر الاختيار لحقن العينة على العمود باستخدام مضخة العينة. تأكد من تحديد المربع الموجود بجوار استخدام معدل التدفق من إعدادات الطريقة في مربع حقن العينة باستخدام مضخة النظام. بجوار مربع مستوى الصوت على الجانب الأيمن من الشاشة ، قم بتغيير القيمة إلى 20 مل.
   6. انقر فوق الزر "غسل العمود". يجب أن تكون القيم المدرجة في الجدول "المخزن المؤقت الأولي B" (4٪) و "المخزن المؤقت النهائي B" (4٪) و "الحجم (CV)" 5. بجوار مخطط تجميع الكسور ، قم بإلغاء النقر فوق مربع تمكين.
   7. انقر فوق زر الشطف. يجب أن تكون القيم المدرجة في الجدول "المخزن المؤقت الأولي B" 0٪ و "المخزن المؤقت النهائي B" 100٪ و "الحجم (CV)" 5. بجوار مخطط جمع الكسور ، انقر فوق مربع التمكين. قم بإلغاء النقر فوق استخدام حجم الكسر من إعدادات الطريقة واضبط حجم الكسر على 4 مل في مربع التعبئة أدناه.
   8. انقر فوق الزر حفظ باسم أعلى البرنامج. قم بتسمية الملف "التوازن".
   9. قم بتوصيل عموده المعبأ مسبقا سعة 5 مل بمنفذ العمود المقابل 3 على FPLC. يجب وضع كل من أنابيب المضخة A والمضخة B ، بالإضافة إلى أنابيب مضخة العينة ، في 0.22 ميكرومتر من المياه منزوعة الأيونات المفلترة. قم بتشغيل برنامج التوازن.
   10. ضع كل من المضخة A والمضخة B ، بالإضافة إلى أنبوب مضخة العينة ، في المخزن المؤقت الخالي من الإيميدازول (Buffer A) وقم بتشغيل بروتوكول التوازن مرة أخرى.
3. اربط العينة بالعمود وقم بتنقية البروتين.
   1. افتح برنامج FPLC وانقر على خيار طريقة جديدة. سيتم فتحه على الفور على قائمة إعدادات الطريقة. ضمن القائمة المنسدلة للعمود ، حدد الموضع اختر C1 المنفذ 3. في القائمة المنسدلة يظهر حسب التقنية، اختر التقارب. في القائمة المنسدلة لنوع العمود ، اختر الآخرين ، Histrap HP ، 5 مل. سيتم ضبط حجم العمود وصناديق الضغط تلقائيا على القيم المناسبة.
   2. انقر فوق الزر "مخطط الطريقة". اسحب الأزرار من القائمة المنبثقة مكتبة المرحلة: التوازن، وتطبيق العينة، وغسل العمود (الغسيل 1)، وغسل العمود (الغسيل 2)، وغسل العمود (الغسيل 3)، والشطف بجوار السهم بهذا الترتيب الدقيق. أغلق قائمة مكتبة المرحلة.
   3. انقر فوق الزر "التوازن". يجب أن تكون القيم المدرجة في الجدول "المخزن المؤقت الأولي B" 4٪ و "المخزن المؤقت النهائي B" 4٪ و "الحجم (CV)" 5.
   4. انقر فوق مربع نموذج التطبيق. في مربع تحميل العينة، انقر فوق زر الاختيار الخاصبعينة I nject على العمود مع مضخة العينة. تأكد من تحديد المربع الموجود بجوار استخدام معدل التدفق من إعدادات الطريقة في حقن العينة باستخدام مربع مضخة النظام.
   5. بجوار مربع مستوى الصوت على الجانب الأيمن من الشاشة ، قم بتغيير القيمة إلى 100 مل. بجوار نظام تجميع الكسور ، انقر فوق الزر تمكين. قم بإلغاء النقر فوق استخدام حجم الكسر من مربع إعدادات الطريقة ثم قم بتغيير حجم الكسر إلى 4 مل.
   6. انقر فوق زر غسيل العمود الأول (الغسيل 1). يجب أن تكون القيم المدرجة في الجدول "المخزن المؤقت الأولي B" 4٪ و "المخزن المؤقت النهائي B" 4٪ و "الحجم (CV)" 10. بجوار نظام تجميع الكسور، انقر فوق المربع تمكين. قم بإلغاء النقر فوق استخدام حجم الكسر من إعدادات الطريقة ثم قم بتغيير حجم الكسر إلى 4 مل.
   7. انقر فوق زر غسيل العمود الثاني (غسل 2). يجب أن تكون القيم المدرجة في الجدول "المخزن المؤقت الأولي B" 0٪ و "المخزن المؤقت النهائي B" 0٪ و "الحجم (CV)" 5. بجوار نظام تجميع الكسور، انقر فوق المربع تمكين. قم بإلغاء النقر فوق استخدام حجم الكسر من إعدادات الطريقة ثم قم بتغيير حجم الكسر إلى 4 مل.
   8. انقر فوق زر غسيل العمود الثالث (Wash 3). يجب أن تكون القيم المدرجة في الجدول "المخزن المؤقت الأولي B" 0٪ و "المخزن المؤقت النهائي B" 0٪ و "الحجم (CV)" 5. بجانب نظام تجميع الكسور، انقر على تمكين. قم بإلغاء النقر فوق استخدام حجم الكسر من مربع إعدادات الطريقة ثم قم بتغيير حجم الكسر إلى 4 مل.
   9. انقر فوق الزر Elution. في الجدول الأيسر، انقر فوق المعلومات المدرجة، وفي القائمة التي ظهرت، انقر فوق خطوة الحذف. اسحب زر التدرج المتساوي إلى الجدول مرتين بحيث يكون هناك إدخالان.
   10. يجب أن تكون قيمة الإدخال الأول "المخزن المؤقت الأولي B" 30٪ و "المخزن المؤقت النهائي B" 30٪ و "Volume (CV)" 10. يجب أن تكون قيمة الإدخال الثاني "المخزن المؤقت الأولي B" 100٪ و "المخزن المؤقت النهائي B" 100٪ و "الحجم (CV)" 10. بجوار نظام تجميع الكسور ، انقر فوق الزر تمكين. انقر فوق المربع بجوار استخدام حجم الكسر من إعدادات الأساليب.
   11. انقر فوق حفظ زر في الجزء العلوي من البرنامج. قم بتسمية الملف "تنقية". يجب وضع المضخة A من أنبوب FPLC في مخزن الغسيل الخالي من الإيميدازول ، بينما يجب وضع أنبوب المضخة B في المخزن المؤقت إيميدازول 500 مليمتر. يجب وضع أنبوب مضخة العينة في عينة 100 مل.
   12. قم بتشغيل برنامج "التنقية" وانتظر الوقت الذي تكون فيه هناك حاجة إلى 60٪ من الأيزوبروبانول (غسل 2). إيقاف البرنامج مؤقتا. انقل المضخة أنبوب من الغسيل الخالي من الإيميدازول إلى غسول الأيزوبروبانول بنسبة 60٪. أعد تشغيل البرنامج.
   13. بمجرد اكتمال خطوة الأيزوبروبانول ، أوقف البرنامج مؤقتا مرة أخرى وانتقل إلى أنبوب المضخة A مرة أخرى إلى مخزن الغسيل الخالي من الإيميدازول. أعد تشغيل برنامج التنقية (يتم تشغيل بقية التشغيل تلقائيا).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 2-بروبانول صياد BP26181 4 لتر أمبيسلين صياد بي ت 1760-25 25 جرام Corning فلتر فراغ يمكن التخلص منه / أنظمة التخزين صياد 09-761-108 مجموعة متنوعة من الأحجام GE Healthcare 5 مل HisTrap HP أعمدة معبأة مسبقا جنرال إلكتريك للرعاية الصحية 45-000-325 5 عبوات الجلسرين صياد ص229-4 4 لتر إيميدازول صياد O3196-500 500 جرام ماجيك ميديا إي قولونية التعبير الوسيط ثيرموفيشر ك 6803 1 لتر MilliporeSigma Millex حقنة معقمة 0.22 مم فلاتر ميليبور SLGV033RB 250 قطعة طلقة واحدة BL21 Star (DE3) بكتريا قولونية مختصة كيميائيا ثيرموفيشر C601003 20 قارورة فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة صياد بي ت 329-500 500 جرام قاعدة تريس صياد ص ب 152-1 1 كجم يوريا صياد ص ب 169-500 2.5 كجم معدات Fiberlite F14-14 × 50cy دوار بزاوية ثابتة ثيرموفيشر 096-145075 الدوار نظام الكروماتوغرافيا NGC Quest 10 بيورراد 7880001 FPLC للمساعدة في تنقية البروتين سونيفر 450 برانسون المعروف أيضا باسم 096-145075 سونيكاتور