$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد. تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
فئة
1. بناء الفئران المتوافقة مع البشر المصممة باستخدام مستقبلات مستضد الخيميري CD4
- معالجة الغدة الصعترية الجنينية وعزل CD34 + HSCs من كبد الجنين
- معالجة الغدة الصعترية
- اغسل الغدة الصعترية برفق في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، درجة الحموضة 7.4 ، في أنبوب مخروطي 15 مل. كرر خطوة الغسيل 3-4 مرات.
- أضف 7 مل من وسائط معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) + 10٪ مصل بقري للجنين (FBS) + بنسلين / ستربتومايسين (قلم / بكتيريا). صب كل شيء في طبق بتري معقم 100 مم.
- استخدم المشارط لتقطيع الغدة الصعترية إلى قطع صغيرة حوالي 1 مم2. ضع كل قطعة من الغدة الصعترية في بئر واحد على طبق 96 بئرا. استخدم ملقطا غير حاد منحنيا عند نقل قطع الغدة الصعترية إلى اللوحة المكونة من 96 بئرا.
- أضف كمية صغيرة من الوسائط (100-200 ميكرولتر) إلى جميع الآبار حتى لا تجف الأنسجة. تخيل تحت المجهر (الغدة الصعترية لها فصوص ويجب أن تبدو مثل أكياس الخلايا).
ملاحظه: تجاهل أي قطع تبدو مشكوك فيها بأي شكل من الأشكال. غالبا ما يكون هناك نسيج ضام ، ولا ينبغي زرعه.
- قم بإزالة قطع الغدة الصعترية المؤكدة وضعها جميعا في قارورة ثقافة خلية T25. أضف 7 مل من وسائط RPMI مع 10٪ FBS و 450 ميكروغرام / مل من البيبيراسيلين / تازوباكتام والأمفوتريسين B. ضع قارورة صخرية برفق للخلط. استزراع القارورة طوال الليل عند 37 درجة مئوية / 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
ملاحظه: هذه الخطوة مطلوبة لمنع التلوث البكتيري للأنسجة.
- (خطوة اختيارية) قم بتجميد الغدة الصعترية لاستخدامها في المستقبل. قم بموازنة القطع في مصل AB البشري بنسبة 90٪ مع 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) لمدة 10 دقائق. قم بتجميدها عند 1 درجة مئوية / دقيقة إلى -50 درجة مئوية ، ثم التبريد السريع إلى -150 درجة مئوية. عندما تكون جاهزا للذوبان ، قم بإذابة الثلج بسرعة في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية واغسله برفق 3x في وسائط RPMI كاملة بدون DMSO.
- معالجة الكبد
- اغسل الكبد برفق في PBS في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. كرر خطوة الغسيل 3-4 مرات.
- أضف 10 مل من وسائط Dulbecco المعدلة من Iscove (IMDM) إلى الأنبوب المخروطي سعة 50 مل. صب كل شيء في طبق بتري معقم 100 مم.
- تجانس أنسجة الكبد باستخدام مشارتين. نقطع الكبد إلى قطع صغيرة حوالي 3 مم2. اقطع وتخلص من أي نسيج ضام أبيض.
- استخدم حقنة سعة 10 مل مزودة بإبرة حادة عيار 16 لالتقاط قطع الكبد والوسائط. ثم انقله إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل.
- أعد تعليق الوسائط وتعليق الأنسجة وطرد 5-7 مرات أخرى لتجانس الأنسجة تماما.
- قم بإعداد وسائط IMDM سعة 10 مل مكملة بالإنزيمات: 500 وحدة / مل كولاجيناز ، و 2,400 وحدة / مل هيالورونيداز ، و 300 وحدة / مل DNase بالإضافة إلى 450 ميكروغرام / مل من البيبيراسيلين / تازوباكتام والأمفوتريسين B. قم بتصفية الوسائط عبر مرشح 0.22 ميكرومتر ثم أضف الوسائط إلى تعليق الكبد.
- قم بتغطية الأنبوب المخروطي سعة 50 مل الذي يحتوي على تعليق الكبد وأغلقه بإحكام بغشاء ذاتي الغلق مثل Parafilm لمنع التسرب. قم بالتدوير في أنبوب دوار في الحاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة.
- قم بتصفية معلق الخلية المهضوم من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر في أنبوب جديد سعة 50 مل.
ملاحظه: أضف PBS إلى التعليق لزيادة الحجم الإجمالي إلى 50 مل. قسم هذا إلى أنبوبين سعة 50 مل ، يحتوي كل منهما على 25 مل من معلق الخلية.
- قم ببطء ورفق بوضع الخلايا في كل أنبوب بوسائط طرد مركزي بكثافة 10 مل (على سبيل المثال ، Ficoll). تدور عند 1,200 × جم لمدة 20 دقيقة بدون فرامل. ملاحظة: تتم جميع عمليات الطرد المركزي المذكورة في هذا البروتوكول في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية).
- قم بإزالة الواجهة بعناية (أي طبقة مصفرة) من كل أنبوب ونقلها إلى أنبوبين منفصلين سعة 50 مل. ارفع حجم كل أنبوب واجهة إلى 50 مل مع PBS. تدور في 300 × جم لمدة 7 - 10 دقائق. شفط طافي بعناية.
- اجمع بين الكريات. اغسل ثلاث مرات أخرى باستخدام 50 مل من PBS يحتوي على 2٪ FBS. تدور في 300 × جم لمدة 7 - 10 دقائق لكل منها أثناء شفط المادة الطافية بعناية.
- أعد تعليق الحبيبات في وسائط RPMI سعة 50 مل + FBS بنسبة 10٪. عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم قبل الشروع في فرز الخلايا.
- وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة ، قم بفرز خلايا CD34 + على الفور باستخدام مجموعة فرز CD34 (على سبيل المثال ، حبات CD34 الدقيقة).
ملاحظه: بدلا من ذلك ، يمكن زراعة الخلايا بين عشية وضحاها في وسائط RPMI + 10٪ FBS عند 1 مليون / مل.
- احفظ كل من CD34 + و CD34- الكسور.
ملاحظه: في هذه الخطوة ، يمكن تجميد خلايا CD34 + و CD34 باستخدام وسائط تجميد Bambanker أو وسائط التجميد الأخرى. قم بتجميد 1 مل من 4 - 6 × 106 خلايا CD34 + لكل أنبوب وتجميد 1 مل من 40 - 60 × 106 خلايا CD34- لكل أنبوب.
- نقل خلايا CD34 +
- احسب عدد آبار التنبيغ المطلوبة للوحة ثقافة الأنسجة المكونة من 6 آبار. يمكن استخدام بئر واحد لتحويل ما يصل إلى 8 × 106 خلايا. لكل فأر نخاع عظمي / كبد / غدة صعترية (BLT) ، سيتم زرع 0.5 × 106 خلايا CD34 + جنبا إلى جنب مع خلايا CD34- والغدة الصعترية أسفل كبسولة الكلى ، وسيتم حقن 0.5 × 106 خلايا CD34 + عن طريق الوريد. يتم تحديد عدد خلايا CD34 + التي سيتم استخدامها من خلال عدد الفئران (1 مليون خلية لكل فأر).
- قم بتغطية العدد المطلوب من آبار الألواح المكونة من 6 آبار غير المعالجة بزراعة الأنسجة ب 1.25 مل من محلول الفبرونيكتين البشري المؤتلف (على سبيل المثال ، Retronectin) (20 ميكروغرام / مل في PBS) في كل بئر. قم بتغطية اللوحة واتركها تقف لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة في خزانة سلامة حيوية نظيفة.
- قم بشفط محلول الفبرونيكتين من الآبار وأضف 1.25 مل من المخزن المؤقت لفرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) (PBS مع 4٪ FBS) إلى كل بئر للسد. اترك اللوحة تقف في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية) لمدة 30 دقيقة.
- قم بشفط FACS Buffer وغسل الآبار مرة واحدة باستخدام PBS.
- احتفظ ب PBS في الآبار المطلية حتى تصبح اللوحة جاهزة للاستخدام. قم بتخزين الطبق على حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل إذا لم يتم استخدامه على الفور.
- خلايا لوحة CD34 + في وسط العدوى (2٪ ألبومين مصل بشري في وسط الخلية التائية الخالية من المصل Yssel) في الآبار المطلية بمحلول الفيبرونيكتين (~ 2 × 106 خلايا / مل) وتحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
- استخدم ماصة لإضافة نواقل الفيروسات العدسية إلى الآبار عند تعدد العدوى (MOI) بين 2 - 10. تخلط بلطف وتحتضن طوال الليل عند 37 درجة مئوية
ملاحظه: يجب تحديد عيار ناقل الفيروس العدسي المستخدم مسبقا.
- احصد الخلايا في اليوم التالي عن طريق كشط قيعان الآبار برفق باستخدام مكشطة خلوية. اجمع الخلايا وعدها باستخدام مقياس كثافة الدم.
- لتحضير الخلايا للزرع ، اجمع بين 0.5 × 106 خلايا CD34 + محولة مع 4.5 × 106 خلايا CD34 لكل فأر ، في أنابيب معقمة بغطاء لولبي 1.5 مل. قم بتدوير الخلايا لأسفل عند 300 × جم إلى الحبيبات وشفط المادة الطافية. قم بتدويرها مرة أخرى عند 300 × جم ، واستنشق أي مادة طافية متبقية باستخدام ماصة P10 ، واستنشق بعناية فائقة. احتفظ بالكريات الجافة على الجليد طوال الدراسة. ملاحظه: للتأكد من أن الخلايا قابلة للحياة ، استخدم الخلايا المحببة وقم بإجراء الجراحة في غضون 2-3 ساعات.
- لتحضير الخلايا للحقن ، قم بتدوير 0.5 × 106 خلايا CD34 + منقولة لكل فأر إلى الحبيبات وشفط المادة الطافية. قم بتعليق الخلايا في وسائط 100 ميكرولتر RPMI لكل فأرة واحتفظ بها على الجليد.
- للتحقق من كفاءة التنبيغ ، aliquot ~ 1 × 105 خلايا CD34 + غير محولة ومحولة من كل حالة وثقافة في وسط سيتوكين 200 ميكرولتر (وسائط RPMI مع 10٪ FBS ، مكملة ب 100 نانوغرام / مل IL-3 البشري ، IL-6 ، SCF) في صفيحة 96 بئر لمدة 5-7 أيام عند 37 درجة مئوية
ملاحظه: لا تستخدم الخلايا المستخدمة في هذه الخطوة للجراحة ولكن لضمان نجاح التنبيغ وأن الناقل ليس ساما لبقاء الخلايا الجذعية وتجديدها. يمكن التحقق من كفاءة التنبيغ من خلال البحث عن التعبير الجيني للناقل (على سبيل المثال ، GFP & CD4) وتحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي.
- زرع الأنسجة لبناء فئران معدلة وراثيا
- في نفس اليوم السابق للجراحة ، يتم إجراء تشعيع الجسم بالكامل للNOD. الفئران المصابة بنقص المناعة Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl / SzJ (NSG) مع مشعاع السيزيوم -137 وجرعة 2.7 غراي (270 راد) .< / >
ملاحظه: تعاني فئران NSG من نقص المناعة بشدة. لذلك ، يجب أن يتوافق سكنهم وصيانتهم مع أعلى المعايير الصحية وأن يتم التعامل معهم من قبل موظفين مدربين تدريبا عاليا.
- تسكب قطع الغدة الصعترية ومتوسطة من القارورة في طبق 60 مم. صب PBS في طبق آخر بحجم 60 مم ، والذي سيتم استخدامه لتنظيف المكملين والحفاظ على الكلى رطبة.
- قم بتبريد أطراف الماصة ذات الإزاحة الموجبة عن طريق وضعها في أنابيب ذات غطاء لولبي معقم معقم سعة 1.5 مل على الثلج. حافظ على الثلج مع كريات الخلايا المجففة وخليط البروتين الجيلاتيني مثل Matrigel.
ملاحظه: من المهم الحفاظ على خليط البروتين الجيلاتيني وأي أنابيب أو أطراف تلمسه باردا حتى يتم تحميل إبرة الزرع.
- تخدير الفئران: قم بوزن الفئران بشكل فردي وسجل الأوزان ؛ لكمة الأذن للفئران لترقيمها. حقنهم داخل الصفاق مع 15 ميكرولتر من الكيتامين (2.6 مجم / مل في محلول ملحي) / زيلازين (100 مجم / مل في محلول ملحي) لكل جرام من وزن الجسم). ضع الفئران مرة أخرى في القفص وانتظر حتى يتم تخديرها بالكامل.
ملاحظه: تحقق من مستوى تخدير الفأر عن طريق الضغط على مخلب. إذا تراجع الفأر بشكل انعكاسي ، فقم بإعطاء 25-50٪ من الكمية الأصلية من الكيتامين / الزيلازين لتخدير الفأر بشكل أكبر. انتظر حتى لا يتردد بشكل انعكاسي لإجراء الجراحة.
- باستخدام ماكينة الحلاقة Oster ، احلق الجانب الأيسر من كل فأر من الورك إلى الكتف بين منتصف الظهر والمعدة. حقن 0.3 مل من الكاربروفين المخفف تحت الجلد (6 ملغ/كغ) في كتف أو المثلث الإربي (حفرة الساق). باستخدام قطعة قطن ، ضع قطرة صغيرة من الدموع الاصطناعية على كل عين وضع الفأر على جانبه في القفص.
ملاحظه: قلل من التحضير للجراحة إلى قفص واحد (حوالي 4-5 فئران) في المرة الواحدة.
- اغسل قنية إبرة غرسة السرطان قياس 16 (المبازل) باستخدام PBS. باستخدام زوج من الملقط المنحني غير الحاد ، ضع قطعة من الغدة الصعترية من الطبق 60 مم في فتحة القنية مع وجود المبزل داخل الفتحة مباشرة ، ثم اسحب المبزل للخلف لشفط الأنسجة في القنية.
- استخدم ماصة إزاحة موجبة وطرف مبرد لوضع 5 ميكرولتر من خليط البروتين الجيلاتيني البارد في الأنبوب باستخدام حبيبات خلية مجففة (خليط CD34 + و CD34 للخلايا المزروعة) وحركها برفق لتوليد تعليق الخلية. لا تقم بسحب الماصة لأعلى ولأسفل. ماصة خليط البروتين الجيلاتيني / تعليق الخلية في فتحة القنية واسحب المبزل ببطء لتحميل الإبرة.
ملاحظه: يوصى بوجود مساعد لتحميل الماصة أثناء معالجة إبرة الغرسة.
- امسح المنطقة المحلوقة من الفأر باستخدام بوفيدون اليود ثم امسح المنطقة بمنديل كحولي ثلاث مرات. تحديد أغمق بقعة تحت الجلد. هذا يشير إلى موقع الطحال. يبلغ طول الكلية حوالي 5 مم ظهرية للطحال. ارفع الجلد بالملقط المنحني وقم بعمل شق بطول 15 مم بمقص جراحي في الجلد الموازي للطحال. ثم قم بعمل قطع مماثل في طبقة الصفاق أدناه. في الذكور ، يجب أن تكون الكلية مرئية بسهولة ويمكن بثقها ببساطة عن طريق الضغط على البطن. يمكنك دعم الكلى باستخدام ملقط محو أو ملقط حاد منحني. في الإناث ، يميل المبيضان إلى منع الكلى من الاستخراج السهل. باستخدام مرقئ ، التقط المبيض وكشف الكلية بعناية.
- استخدم الملقط ذو الرؤوس الإبرة لنتف ثقب صغير في الطرف الخلفي من كبسولة الكلى.
ملاحظه: لا تستخدم هذه الملقط ذو الرؤوس الإبرة للتعامل مع المواد الخطرة البيولوجية.
- حرك إبرة الزرع في هذه الفتحة وعلى طول الكلية حتى يتم تغطية فتحة القنية بالكامل بواسطة كبسولة الكلى.
قم - ببثق الأنسجة الموجودة أسفل كبسولة الكلى برفق واسحب الإبرة للخارج. يمكن أن تكون قطع الغدة الصعترية لزجة ، لذا استخدم ملقطا منحنيا للتأكد من أن قطعة الغدة الصعترية لا تخرج بالإبرة.
- ارفع الصفاق بالملقط واستخدم المملق برفق لدفع الكلية إلى مكانها. اربط غرزة مزدوجة العقد في الصفاق باستخدام 4-0 خيوط فيكريل قابلة للامتصاص. استخدم مشابك الجرح Autoclips لإغلاق الجلد.
- امزج خلايا CD34+ المنقولة الموضوعة جانبا للحقن وامتصها 100 ميكرولتر (0.5 × 106 خلايا) في حقنة الأنسولين. حقن هذه الخلايا في الفأر من خلال حقن الوريد خلف الحجاج أو طرق أخرى للحقن في الوريد. باستخدام قطعة قطن ، ضع قطرة صغيرة من الدموع الاصطناعية على كل عين وضع الفأر على جانبه في قفص.
- بمجرد زرع جميع الفئران ، تأكد من أن تستعيد وعيها وتتجول بشكل طبيعي قبل مغادرتها.
- رعاية ما بعد الجراحة: حقن 0.3 مل من الكاربروفين المخفف (6 مجم / كجم) و 1.2 مل من المحلول الملحي المعقم تحت الجلد في كل فأر في اليوم التالي للجراحة. بعد 2 و 3 أيام من الجراحة ، يتم حقن 1.5 مل من محلول ملحي معقم تحت الجلد في كل فأر. راقب الفئران والشقوق لمدة 10-14 يوما بعد الجراحة. قم بإزالة المشابك التلقائية ووزن الفئران بعد 10-14 يوما. ملاحظه: الفئران بطيئة بعد الإشعاع ، والحقن الملحي يمنع من الجفاف.
- بعد 8-10 أسابيع ، تحقق من النقش عن طريق نزيف الفئران وإجراء تحليل FACS على الدم المحيطي ، وتلوين علامات مثل CD45 و CD3 و CD4 و CD8 وأي جينات يجب أن يعبر عنها الناقل.