$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >
1. تجميع الجهاز
- لضمان العقم، قم بتشغيل ضوء الأشعة فوق البنفسجية (UV) لشفاط مزرعة الأنسجة لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام.
- قم بفك وحدة مرشح مقاس 25 مم يمكن التخلص منها واغمر غطاء الوحدة وقاعها في كوب زجاجي سعة 200 مل مملوء بنسبة 75٪ من الإيثانول لمدة 30 دقيقة. الوحدة مصنوعة من مادة البولي بروبيلين الطبية
- التقط غطاء وأسفل الوحدة باستخدام الملقط ، وتخلص من الإيثانول المتبقي يدويا ، واترك الأجزاء تجف في الهواء لمدة 10 دقائق في الغطاء.
- بلل غشاء بولي كربونات مقاس 19 مم في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) وضعه بعناية فوق المصفوفة الداعمة لقاع الوحدة. يحتوي فيلم البوليمر على سطح أملس ومسطح ومسام محفورة بطول 3 ميكرومتر.
- أعد تجميع الوحدة عن طريق شد الغطاء بإحكام على الجزء السفلي. تأكد من عدم إزاحة الغشاء من المركز.
- قم بإزالة إبرة حقنة الأنسولين سعة 1 مل واسحب 1 مل من PBS. قم بتوصيل المحقنة بوحدة الفلتر ثم ادفع PBS عبر الوحدة لتبليل المجموعة واختبار ما إذا كان هناك أي تسرب.
< p class = "jove_title" >
2. توليد حويصلات غشاء البلازما (PMVs)
- إنشاء مزرعة الخلايا الجذعية الوسيطة لنخاع العظم (BMSC) ، كما أفاد نيميث وآخرون ، في وسط ثقافة النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco الذي يحتوي على 15٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين. ازرع الخلايا في صفيحة من 6 آبار في حاضنة رطبة تحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 عند 37 درجة مئوية.
- لتكاثر الخلايا ، قم بإزالة وسط المزرعة وشطف البئر ب 0.5 مل من PBS الخالي من الكالسيوم.
- أضف 0.5 مل من 0.25٪ حمض التربسين - إيثيلين ديامين رباعي الأسيتيك (التربسين-EDTA) واحتضن الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. أوقف الهضم بإضافة 1 مل من وسط الزراعة.
- اجمع الخلايا في أنبوب مخروطي سعة 15 مل وقم بالدوران عند 200 × جم لمدة دقيقتين في جهاز طرد مركزي على سطح المقعد. أعد تعليق الخلايا في 4 مل من وسط المزرعة وقم بتقسيم الخلايا إلى بئرين من صفيحة 6 آبار. < / >
ملاحظه: عادة ما تصل الخلايا إلى التقاء في حوالي 24 ساعة.
- لتوليد PMVs ، قم بحصاد الخلايا من بئر واحد (حوالي 5 × 105 خلايا) من صفيحة مكونة من 6 آبار عن طريق هضم التربسين وتشتت الخلايا أحادية في 0.5 مل من وسط الاستزراع.
- قم بتحميل الخلايا في حقنة الأنسولين ، وقم بتوصيلها بوحدة المرشح ، وادفع المكبس بسرعة للضغط على الخلايا عبر الفلتر. تجاهل الوسيط المبثوق لأنه يجب أن يكون هناك عدد قليل من PMVs بداخله.
- قم بتحميل 0.5 مل إضافي من الوسط في المحقنة وادفعه بسرعة عبر الفلتر. جمعت وسط البثق الثاني ، والذي يحتوي على PMVs بأحجام مختلفة.
- قم بتحميل 150 ميكرولتر من الوسط الذي تم جمعه في طبق ذو قاع زجاجي مقاس 35 مم واسمح لأجهزة PMV بالاستقرار في القاع لمدة 10 دقائق تقريبا. افحص PMVs تحت مجهر تباين الطور المقلوب المزود بكاميرا CCD باستخدام عدسة موضوعية 20X.