التوصيل الفموي لخلايا الخميرة المحولة إلى الجهاز المناعي المعوي للفأر

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Hudson ، L. E. et al. ، تحويل خميرة البروبيوتيك وتعافيها من الأنسجة المناعية المعدية المعوية بعد التزقيم الفموي في الفئران.J. Vis. Exp. (2016)

يعرض هذا الفيديو الإعطاء الفموي لخلايا الخميرة المحولة إلى نموذج فأر. يتم إعطاء خلايا الخميرة المحولة عن طريق الفم باستخدام تقنية التزقيم ، وتصل إلى معدة الفأر. في وقت لاحق ، تهاجر الخلايا إلى الأمعاء الدقيقة ، حيث تبتلعها الخلايا الدقيقة وتسهل نقلها إلى بقع باير والوصول إلى الجهاز المناعي المعوي.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. الطفرات فوق البنفسجية لتوليد سلالات الخميرة المضادة للتغذية

1. توليد منحنيات البقاء على قيد الحياة لتحديد الجرعات المطلوبة من الأشعة فوق البنفسجية (UV)
   1. قم بإعداد وسائط YPD (مستخلص الخميرة من الببتون وسكر العنب) والكواشف الأخرى المدرجة في الجدول 1 وفقا للإجراءات القياسية وتلقيح المستعمرات المفردة في 5-10 مل من وسائط YPD. احتضان الثقافات على أسطوانة أسطوانية عند 30 درجة مئوية O / N إلى التشبع لمدة 8 ساعات على الأقل.
   2. حدد تركيز الخلية للثقافات الليلية (O / N) باستخدام مقياس الطيف الضوئي عن طريق تخفيف الخلايا 1:10 في الماء في كوفيت بلاستيكي. تمييع الخلايا بتركيز 10⁷ خلايا / مل في 20 مل من الماء المقطر المعقم.
   3. صب الخلايا المخففة في طبق بتري بلاستيكي معقم ، ومع إزالة الغطاء ، ضع اللوحة 14 سم أسفل لمبة الأشعة فوق البنفسجية.
   4. تعريض الخلايا لجرعات تسلسلية تبلغ 5,000 ميكروجول و 10,000 ميكروجول من الأشعة فوق البنفسجية ، واستخراج 500 ميكرولتر من الخلايا بعد كل زيادة بحيث يتم أخذ عينات من الخلايا بعد التعرض ل 0 ميكروجول ، 5,000 ميكروجول ، 10,000 ميكروجول ، 15,000 ميكروجول ، 20,000 ميكروجول ، 25,000 ميكروجول ، 30,000 ميكروجول ، 40,000 ميكروجول ، و 50,000 ميكروجول من الأشعة فوق البنفسجية. نقل عينات الخلايا المستخرجة إلى أنابيب معقمة سعة 1.5 مل وتخفيفها بشكل متسلسل بزيادات قدرها 1:10 في الماء المعقم.
   5. خلايا الحبيبات في كل تخفيف عن طريق الطرد المركزي في جهاز طرد مركزي دقيق عند 16,000 × جم لمدة 1 دقيقة. قم بعرض الحجم الكامل للخلايا المعلقة على ألواح تحتوي على وسائط صلبة YPD واستخدم موزعة معقمة لتوزيع الخلايا بالتساوي عبر كل لوحة.
   6. لف حواف الألواح في Parafilm لمنع جفاف الوسائط وألواح الغطاء في رقائق الألومنيوم لمنع إعادة تنشيط الصور وإصلاح الطفرات التي تسببها الأشعة فوق البنفسجية. احتضان الصفائح رأسا على عقب عند 30 درجة مئوية لمدة 2-4 أيام للسماح بنمو مستعمرات الخميرة القابلة للحياة (الشكل 1).
   7. احسب عدد المستعمرات ، اختياريا بمساعدة قلم لتمييز المستعمرات المحسوبة ، أو قلم مضاد إلكتروني محمول باليد ، أو حامل مضاد مع تكبير. ارسم كنسبة مئوية من إجمالي الخلايا المطلية عند كل جرعة ميكروجول من الأشعة فوق البنفسجية لتوليد منحنى بقاء للخميرة المشعة (الشكل 2).
      ملاحظة: من المتوقع أن تتطلب سلالات الخميرة أحادية الصيغة الصبغية جرعات أقل من الأشعة فوق البنفسجية مقارنة بالسلالات ثنائية الصبغيات للوصول إلى نفس النسبة المئوية للبقاء على قيد الحياة. يمكن استخدام سلالة من الخميرة تفتقر إلى إنزيمات إصلاح الحمض النووي الوظيفية ، مثل rad1 S. cerevisiae المتحولة ، كعنصر تحكم إيجابي للإشارة إلى وجود تشعيع الأشعة فوق البنفسجية بجرعات منخفضة جدا.
   8. تحديد جرعة الطفرات فوق البنفسجية التي سيتم استخدامها للفحص من خلال الرجوع إلى منحنى البقاء على قيد الحياة المحدد في 1.1.7. قيمة x للنقطة على طول منحنى البقاء على قيد الحياة حيث y يساوي 50 هي جرعة الأشعة فوق البنفسجية التي تعيش عندها 50٪ من الخميرة. قد يؤدي فحص الطفرات عند هذه النسبة المئوية المنخفضة للبقاء على قيد الحياة إلى زيادة إنتاجية السلالات المتحولة بنجاح ، خاصة بالنسبة للخميرة ثنائية الصبغيات. ال 50٪ جرعة البقاء على قيد الحياة ل WT S. بولاردي, كما هو موضح في الشكل 2, حوالي 18,000 ميكروجول.
      ملاحظة: على الرغم من أن هذه الجرعات العالية من الأشعة فوق البنفسجية تزيد من خطر حدوث طفرات في الجينات للمسارات الخلوية بخلاف جين علامة التغذية المثيرة للاهتمام ، إلا أنه يجب موازنة هذا العيب مع الحاجة إلى إحداث طفرات في كلتا النسختين من جين علامة التغذية السريعة. بالنسبة للسلالات أحادية الصيغة الصبغية التي يجب فيها تحور نسخة جينية واحدة فقط ، فإن الفحص بنسبة أعلى للبقاء على قيد الحياة ، مثل 90٪ ، يقلل من خطر حدوث طفرات إضافية ولا يزال يسمح بتوليد كاف من الطفرات المضادة.
2. الطفرات فوق البنفسجية وفحص سلالات الخميرة المضادة للتغذية
   1. تحضير الخميرة كما هو موضح في الخطوات 1.1.1-1.1.3.
   2. تعريض الخميرة لجرعة الأشعة فوق البنفسجية المقابلة للبقاء على قيد الحياة بنسبة 50٪ ، كما هو محدد في 1.1.8. ل WT S. بولاردي, تم تحديد هذه الجرعة لتكون حوالي 18,000 ميكروجول (الشكل 2).
   3. اجمع كميات 1 مل من الخميرة والحبيبات المشعة بالأشعة فوق البنفسجية عن طريق الطرد المركزي في جهاز طرد مركزي دقيق عند 16,000 × جم لمدة 1 دقيقة.
      1. اختيار المسوخ
         1. في حالة استخدام الاختيار مثل الطفرات المضادة للتغذية الكهربية ، فإن الخميرة المشعة على وسائط تحتوي على حمض 5-فلوروروتيك (5-FOA) لاختيار الخلايا التي تفتقر إلى إنزيم Ura3 الوظيفي.
            ملاحظة: أي خميرة تحتوي على نسخ وظيفية من Ura3 ستحول 5-FOA إلى السم 5-فلورويوراسيل ، مما يؤدي إلى موت الخلايا والسماح بالاختيار السهل لمستعمرات ura3 التي تفتقر إلى Ura3 وظيفية. مناهج الاختيار المماثلة ممكنة ل LYS2 و LYS5. TRP1;وعلامات MET2 و MET15 باستخدام وسائط تحتوي على حمض α-أمينوأديبيك. 5-حمض الفلوروأنترانيليك. وميثيل الزئبق ، على التوالي.
         2. قم بضرب 100 ميكرولتر من الخلايا المعلقة على الحد الأدنى من الوسائط التي تحتوي على 5-FOA واستخدم موزعة معقمة لتغطية اللوحة بالتساوي. لف الألواح في بارافيلم واحتضانها رأسا على عقب عند 30 درجة مئوية لمدة 2-4 أيام للسماح بنمو مستعمرات الخميرة القابلة للحياة.
         3. تأكد من النمط الظاهري ل ura3- لأي مستعمرة تظهر على لوحات 5-FOA عن طريق إعادة التركيب على ألواح YPD و uracil^- و 5-FOA (الشكل 3). استخدم طرف عود أسنان معقم لجمع جزء من مستعمرة واحدة واسحب الخلايا برفق عبر ألواح YPD و ^{uracil و} 5-FOA الطازجة. مرة أخرى ، احتضان الألواح الملفوفة رأسا على عقب عند 30 درجة مئوية لمدة 2-4 أيام. < / > ملاحظة: ستظهر المستعمرات القابلة للحياة على شكل زيادات دائرية مرتفعة تقريبا بينما ستظهر الخلايا غير القابلة للحياة فقط على شكل مسحة غير شفافة دون أي نمو مرتفع (الشكل 3).
      2. فحص المسوخ
         1. في حالة توليد طفرة أوكسوتروفية لا تتوفر طرق الاختيار لها ، قم بإعداد تخفيفات تسلسلية 1:10 لخلايا الخميرة المشعة بالأشعة فوق البنفسجية في ماء معقم وماصة التخفيفات على وسائط YPD ، باستخدام موزعة معقمة لتغطية اللوحة بالتساوي.
         2. لف الألواح في بارافيلم واحتضانها رأسا على عقب عند 30 درجة مئوية لمدة 2-4 أيام. حدد التخفيف المسموح بنمو المستعمرات الفردية التي يمكن تمييزها بسهولة عن بعضها البعض ، وعادة لا تزيد عن 100 مستعمرة لكل لوحة.
         3. كرر طفرات الأشعة فوق البنفسجية لعينات الخميرة كما هو موضح في 1.2.1-1.2.3 والخلايا الصفيحية عند هذا التخفيف المحدد. قم بتقطيع الخميرة المخففة على وسائط YPD ، واستخدم موزعة معقمة لتوزيع الخلايا ، واحتضان الألواح الملفوفة رأسا على عقب عند 30 درجة مئوية لمدة 2-4 أيام.
         4. شاشة للأكسوتروف عن طريق الطلاء المقلد على وسائط انتقائية تفتقر إلى المستقلب المثير للاهتمام. أولا ، قم بتأمين وسادة مخملية معقمة على حامل لوحة واقلب اللوحة بمستعمرات مشعة بالأشعة فوق البنفسجية على المخمل ، مع تحديد اتجاه اللوحة.
         5. بعد ذلك ، اقلب صفيحة جديدة تفتقر إلى المستقلب ذي الأهمية على المخمل واضغط برفق لأسفل لنقل الخلايا من المخمل إلى اللوحة. قم بتخزين اللوحة الأصلية عند 4 درجات مئوية ، لف اللوحة الجديدة واحتضانها رأسا على عقب عند 30 درجة مئوية لمدة 2-4 أيام.
         6. كبديل للطلاء المتماثل ، قم بفحص المسوخات عن طريق إعادة ربط المستعمرات من YPD على الوسائط الانتقائية. استخدم طرف عود أسنان معقم لجمع جزء من مستعمرة واحدة واسحب الخلايا برفق عبر لوحة YPD جديدة ولوحة تفتقر إلى المستقلب المثير للاهتمام. مرة أخرى احتضان الألواح الملفوفة رأسا على عقب عند 30 درجة مئوية لمدة 2-4 أيام. < / > ملاحظة: يجب توخي الحذر لتحديد مستعمرات مفردة وإخراج المستعمرات عدة مرات لتأكيد وجود مجموعة متجانسة من الخلايا الحقيقية التغذية.
   4. تأكد بشكل أكبر من النمط الظاهري للخلايا المشعة عن طريق تلقيح مستعمرات مفردة في 5-10 مل من كل من YPD والوسائط التي تفتقر إلى المستقلب المناسب (على سبيل المثال ، في ^{اليوراسيل -} الوسائط ل ura3^- متحولة). احتضان على أسطوانة أسطوانية عند 30 درجة مئوية O / N لتأكيد نمو الخلايا في وسائط YPD ولكن ليس في حالة عدم وجود مستقلب. < / > ملاحظة: على الرغم من أن أنماط النمو على الوسائط الصلبة يجب أن تشير بوضوح إلى حالة الخميرة المضادة للتغذية ، فمن الممكن لبعض الخميرة أن تتحمل الضغوط وتشكل مستعمرات صغيرة بطيئة النمو على الوسائط الصلبة ولكن مع ذلك لا تتسامح مع نفس الظروف في الوسائط السائلة (ملاحظات غير منشورة). وبالتالي يجب إجراء التلقيح في المزارع السائلة لتأكيد أنماط نمو المسوخ المشعع بالأشعة فوق البنفسجية.
   5. للتخزين طويل الأمد للطفرات المؤكدة ، قم بإعداد مخزونات الجلسرين عن طريق تلقيح الخلايا في 10 مل YPD واحتضانها على أسطوانة أسطوانية O / N عند 30 درجة مئوية. خلايا الحبيبات عن طريق الطرد المركزي لمدة 3 دقائق عند 2,500 × جم ووسائط الشفط. أعد تعليق الخلايا في الجلسرين المصفى المعقم بنسبة 50٪ ، وانقلها إلى كريوفيال ، وخزنها عند -80 درجة مئوية.
      ملاحظة: من المحتمل أن تحتوي الخميرة المطفرة بالأشعة فوق البنفسجية على طفرات في جينات متعددة بخلاف علامة التغذية المثيرة للاهتمام. قبل الاستمرار في استخدام الطفرات التي تم التحقق منها ، يجب تحليل هذه السلالات بشكل أكبر من خلال التسلسل الجيني وتقييم مقاومة الأس الهيدروجيني وإجهادات الأحماض الصفراوية والخصائص الأخرى ذات الصلة بسلالات البروبيوتيك ، كما هو موضح في مكان آخر². بالإضافة إلى ذلك ، يجب اعتبار استخدام تماثل تفاعل البوليميراز المتسلسل أو استهداف CRISPR / Cas9 لعلامات التغذية السريعة بشكل أكثر تحورة بشكل انتقائي كبديل للطفرات بالأشعة فوق البنفسجية.

فئة

2. تحول الخميرة

1. تحويل LiOAc للخميرة
   1. تلقيح مستعمرات الخميرة المفردة في 5-10 مل من وسائط YPD واحتضانها على أسطوانة أسطوانية عند 30 درجة مئوية O / N.
   2. للحث على نمو مرحلة السجل وزيادة كفاءة امتصاص البلازميد ، حدد تركيز الخلية باستخدام مقياس الطيف الضوئي لقياس تخفيف الخلايا بنسبة 1:10 في الماء المعقم في كوفيت بلاستيكي. تمييع مزارع O / N إلى كثافة بصرية عند 600 نانومتر (OD₆₀₀) من 0.16-0.2 (حوالي 2 × 10⁶- 2.5 × 10⁶ خلايا / مل) في 50 مل من YPD الدافئ الطازج واحتضان الخلايا على شاكر منصة مدارية مضبوطة على 200 دورة في الدقيقة حتى تصل المزرعة إلى حوالي 1 × 10⁷ خلايا / مل ، عادة حوالي 4 ساعات
      ملاحظة: يمكن قياس كفاءة التحويل كدالة لعدد وحدات تشكيل مستعمرة الخميرة المحولة بنجاح (CFU) لكل ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد. تؤدي الكفاءة المتزايدة إلى المزيد من المستعمرات المتحولة لكل ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد. يعد زراعة خلايا الخميرة الفرعية وجمعها أثناء نمو مرحلة السجل أحد العوامل التي تزيد من كفاءة التحول.
   3. خلايا الحبيبات عن طريق الطرد المركزي عند 2,500 × جم لمدة 3 دقائق.
   4. شفط المادة الطافية ونقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل عن طريق تعليق الحبيبات في 1 مل ماء معقم.
   5. خلايا الحبيبات عن طريق الطرد المركزي عند 16,000 × جم لمدة 1 دقيقة في جهاز طرد مركزي دقيق ، شفط المادة الطافية وغسل الخلايا عن طريق إعادة التعليق في 1 مل TE / LiOAc (Tris EDTA / أسيتات الليثيوم).
   6. كرر الطرد المركزي وأعد تعليق الخلايا في المخزن المؤقت TE / LiOAc إلى تركيز 2 × 10⁹ خلايا / مل.
   7. قم بإعداد مخاليط التحويل مع كل مما يلي: 50 ميكرولتر من الخميرة المحضرة في المخزن المؤقت TE / LiOAc ، و 5 ميكرولتر من الحمض النووي الحامل (10 ميكروغرام / ميكرولتر) ، و 1 ميكرولتر من الحمض النووي البلازميد (1 ميكروغرام). يمكن معايرة ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد لأن زيادة كميات الحمض النووي قد تؤدي أو لا تؤدي إلى زيادة كفاءة التحول. < / > ملاحظة: بالنسبة لسلالة الخميرة الطافرة التي تفتقر إلى علامة أوكسوتروفيت واحدة ، يمكن تحويل بلازميد واحد فقط يشفر العلامة لكل عينة. علاوة على ذلك ، فإن استخدام البلازميد الذي يشفر بروتينا يمكن اكتشافه بسهولة ، مثل بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) ، سيسمح بالتحديد الفعال للطي الصحيح والتعبير عن البروتين غير المتجانس بواسطة سلالة الخميرة بعد التحول.
   8. أضف إلى كل مستحضر 300 ميكرولتر من PEG / LiOAc / TE والدوامة جيدا. يعد حضانة الخلايا السليمة باستخدام البولي إيثيلين جلايكول (PEG) أمرا ضروريا للتحول الفعال.
   9. احتضان المستحضرات عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع التحريك عن طريق وضع أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة في دورق يوضع على شاكر منصة مدارية عند 200 دورة في الدقيقة.
   10. أضف 35 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) إلى كل تفاعل وخلايا صدمة حرارية لمدة 15 دقيقة في حمام مائي 42 درجة مئوية. على الرغم من وجود تقارير متضاربة حول الفائدة الإضافية ل DMSO ، فقد ثبت أن الصدمة الحرارية لخلايا الخميرة السليمة تزيد بشكل كبير من كفاءة التحول.
   11. اغسل الخلايا عن طريق التكوير عن طريق الطرد المركزي كما في 2.1.5 ، وشفط أو سحب العينة من المادة الطافية ، وإعادة تعليقها في 1 مل من الماء المعقم. ماصة برفق لأعلى ولأسفل لتفتيت حبيبات الخلية. < / > ملاحظة: من الأهمية بمكان إزالة المادة الطافية تماما لأن الوسائط المستخدمة في توليد الخلايا المختصة يمكن أن تمنع نمو الخميرة وتكوين المستعمرة.
   12. كرر تكوير الخلايا كما في 2.1.5 ، وشفط المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من الماء المعقم. قم بتقطيع الحجم الكامل على صفيحة انتقائية واستخدم موزعة معقمة لطلاء اللوحة بالتساوي بالخميرة المحولة.
   13. لف حواف الألواح المطلية في Parafilm لمنع جفاف الوسائط واحتضانها رأسا على عقب عند 30 درجة مئوية لمدة يومين للسماح بنمو خلايا الخميرة المحولة. ينتج عن التحول الناجح والفعال والاختيار الصوتي للخميرة الخميرة عددا كبيرا من المستعمرات لكل تحضير للتحول ، على الرغم من أن العائد يمكن أن يكون أقل بكثير بالنسبة للسلالات الأخرى (الشكل 4).
   14. قم بتخزين ألواح الخميرة على المدى القصير (بشكل عام 1-3 أسابيع) رأسا على عقب ومغطاة عند 4 درجات مئوية. قم بإعداد مخزون الجلسرين من الخميرة المحولة كما هو موضح في 1.2.5 للتخزين طويل الأجل. < / > ملاحظة: من الضروري إجراء مزيد من الدراسات التي تختبر CFU المحولة لتحديد استقرار البلازميد وتقييم التعبير السليم للبروتين غير المتجانس. تتوفر أوصاف شاملة لاستقرار البلازميد ، واستخدام النشاف المناعي للكشف عن البروتينات المشوهة المستردة من عينات الخلايا ، ومقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) للكشف عن البروتينات ثلاثية الأبعاد المطوية بشكل صحيح ، واستخدام GFP في دراسات الخميرة في مكان آخر. يوضح الشكل 5 صورة تمثيلية لتعبير GFP الناجح في S. cerevisiaeبالنسبة للخلايا غير المحولة. يعد استخدام مثل هذا البروتين الفلوري إحدى وسائل تحديد إنتاج البروتين غير المتجانس الناجح بكفاءة.
2. التثقيب الكهربائي للخميرة
   1. قم بتلقيح مستعمرات الخميرة المفردة في 5-10 مل من وسائط YPD واحتضانها على أسطوانة أسطوانية عند 30 درجة مئوية O / N.
   2. حدد تركيز الخلية باستخدام مقياس الطيف الضوئي لقياس تخفيف الخلايا بنسبة 1:10 في الماء المعقم. تمييع مزارع O / N في وسائط YPD الدافئة الطازجة 100 مل إلى OD₆₀₀ ما يعادل 0.3 تقريبا. احتضان المزارع الفرعية عند 30 درجة مئوية على شاكر منصة مدارية مضبوطة على 200 دورة في الدقيقة حتى تصل إلى OD₆₀₀ من حوالي 1.6 ، عادة 4-5 ساعات. ستولد كل ثقافة فرعية سعة 100 مل خلايا مكيفة كافية لتفاعلين تحوليين.
   3. خلايا الحبيبات عن طريق الطرد المركزي عند 2,500 × جم لمدة 3 دقائق. كرر الغسيل عن طريق تكوير الخلايا ، وشفط المادة الطافية ، وإعادة التعليق في ماء معقم مثلج طازج سعة 50 مل.
   4. حبيبات الخلايا مرة أخرى وإعادة تعليقها في 50 مل من المخزن المؤقت للتثقيب الكهربائي المثلج (1 م سوربيتول ، 1 ملي كلوريد الكالسيوم (CaCl₂)).
   5. كرر الدوران كما في 2.2.3 ، وشفط الطاف ، وأعد تعليق الخلايا في 20 مل 0.1 M LiOAc / 10 ملي مولار ثنائي ثيوثريتول (DTT). احتضان تعليق الخلية على أسطوانة أسطوانية عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. يزيد الحضانة المسبقة للخلايا في LiOAc و DTT بشكل تآزري من كفاءة التثقيب الكهربائي.
   6. قم بتكبيل الخلايا كما في 2.2.3 ، وقم بإزالة المادة الطافية ، وغسلها عن طريق التعليق في 50 مل من التخزين المؤقت للتثقيب الكهربائي المثلج. كرر الطرد المركزي وأعد تعليق الخلايا في مخزن التثقيب الكهربائي المثلج البارد إلى الحجم النهائي 1 مل.
   7. استعد على الجليد: خلايا الخميرة المكيفة ، كوفيت التثقيب الكهربائي المعقم ، والحمض النووي البلازميدي. مباشرة بعد إعادة التعليق النهائي للخلايا المكيفة في مخزن مؤقت للتثقيب الكهربائي سعة 1 مل ، اجمع بين 400 ميكرولتر من خلايا الخميرة المكيفة مع ما يقرب من 1 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد وأضفها إلى كوفيت التثقيب الكهربائي المثلج 0.2 ميكرومتر. قد يؤدي استخدام كميات متزايدة من الحمض النووي إلى زيادة كفاءة التحويل بشكل طفيف. احتضان التفاعل على الجليد لمدة 5 دقائق ، ثم التثقية الكهربائية باستخدام المثق الكهربائي المضبوطة على 2.5 كيلو فولت و 25 ميكرومتر فهرنهايت.
      ملاحظة: كما هو موضح في 2.1.7 ، يمكن تحويل سلالة الخميرة الطافرة التي تفتقر إلى علامة واحدة بلازميد واحد فقط يشفر العلامة المتحولة لكل عينة. أيضا ، فإن استخدام البلازميد الذي يشفر بروتين يمكن اكتشافه بسهولة مثل GFP يسمح بالتحديد الفعال للطي الصحيح والتعبير عن البروتين غير المتجانس بعد التحول.
   8. انقل الخلايا الكهربائية إلى 8 مل من خليط 1: 1 من YPD: 1 M sorbitol واسمح للخلايا بالتحتضن على أسطوانة أسطوانية عند 30 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
   9. خلايا الحبيبات كما في 2.2.3 وتتوقف في 100 ميكرولتر 1: 1 YPD: 1 M سوربيتول. ضع الحجم الكامل على وسائط انتقائية تحتوي على 1 متر من السوربيتول ، ولف حواف الألواح في بارافيلم ، واحتضن الألواح رأسا على عقب عند 30 درجة مئوية لمدة 2-5 أيام للسماح بنمو خلايا الخميرة المحولة. < / > ملاحظة: من الأهمية بمكان اختبار الخميرة المحولة لتقييم التعبير الصحيح للبروتين غير المتجانس ، كما هو موضح في 2.1.14 و 2.2.7.
3. التزقيم الفموي للفئران مع الخميرة المتحولة
   1. القيام بجميع إجراءات رعاية والتعامل معها وفقا لدليل رعاية واستخدام المختبر وموافقة لجنة رعاية واستخدام المؤسسية.
   2. قم بإعداد مزارع الخميرة O / N عن طريق تلقيح مستعمرات مفردة من الخميرة المضادة للتغذية المحولة إلى 5-10 مل من الوسائط الانتقائية. احتضان الثقافات O / N لمدة 8 ساعات على الأقل على أسطوانة أسطوانية عند 30 درجة مئوية حتى تشبع.
      ملاحظة: سيسمح استخدام بروتينات اختبار ترميز البلازميد مثل GFP بسهولة اختبار تعبير البروتين في الخميرة المخزنة ، كما هو موضح في 4.7.
   3. من أجل الحث الأقصى للتعبير عن البروتين وللحث على نمو طور السجل ، قم بإعداد المزارع الفرعية من مزارع O / N عن طريق التخفيف إلى OD₆₀₀ مكافئ حوالي 0.16-0.2 في 50 مل من الوسائط المناسبة كما هو موضح في 2.1.2.
   4. حدد تركيز الخلايا المزروعة الفرعية كما في 1.1.2 واضبطها على 10⁹ خلايا / مل. قم بإعداد جرعة 100 ميكرولتر لكل فأر ، مع بضع مئات من الميكرولتر من الحجم الإضافي لكل مجموعة لتحسين دقة وسهولة تحميل العينة.
   5. خلايا الحبيبات عن طريق الطرد المركزي عند 2,500 × جم لمدة 3 دقائق أو في جهاز طرد مركزي دقيق عند 16,000 × جم لمدة 1 دقيقة.
   6. قم بتثبيت إبرة تزقيم ذات مقياس مناسب (22 جم للفئران 15-20 جم) على حقنة معقمة سعة 1 مل وقم بتحميل عينة الخميرة ، مع التأكد من التخلص من أي فقاعات وضبط المكبس على زيادة قدرها 100 ميكرولتر. قم بتحميل حقنة إضافية بالماء المعقم لتزقيم الفئران التي تتحكم فيها والتحقق من وجود أي خميرة ملوثة.
   7. التقط الماوس ليتم تنظيفه باستخدام اليد غير المهيمنة ، مع إمساك السبابة والإبهام بإحكام بالجلد حول الرقبة (الشكل 5 أ). دس الذيل تحت الإصبع الصغير لمنع حركة الجزء السفلي من الجسم. تأكد من أن القبضة آمنة وتمنع الماوس من تحريك رأسه لمنع تلف الأنسجة الداخلية أثناء التزقيم. < / > ملاحظة: قم بتقدير المسافة التي يجب إدخال إبرة التزقيم عن طريق إمساك الإبرة بالفأر بحيث تكون اللمبة متساوية مع عملية خنجري القص. عادة ما يسمح إدخال هذا الطول من الإبرة لمصباح إبرة التزقيم بدخول المعدة.
   8. باستخدام اليد المهيمنة ، أدخل إبرة التزقيم برفق في مريء الفأر عن طريق تحريك الإبرة بزاوية على طول سقف الفم ومؤخرة الحلق ، مع الحفاظ قليلا على يسار المركز. انتظر حتى يبتلع الفأر لمبة الإبرة واترك الإبرة تنزل قليلا إلى النقطة المقدرة في 3.7 (الشكل 5 ب). إذا شعرت بأي مقاومة أثناء إدخال إبرة التزقيم أو إذا بدأ الماوس في أي وقت في اللهاث ، فقم بإزالة الإبرة برفق وحاول مرة أخرى العثور على المريء.
   9. بعد أن يبتلع الفأر لمبة إبرة التزقيم ، اضغط برفق على مكبس المحقنة لإدارة 100 ميكرولتر (10⁸ CFU) من الخميرة مباشرة في معدة الفأر.
      ملاحظة: على الرغم من أن الفئران غير قادرة على تقيؤ أي من المحلول المتزقيم بعد تناوله ، فمن الممكن أن يحدث الارتجاع أثناء التزقيم. يمكن أن يساعد الإدخال الصحيح لإبرة التزقيم ، بالإضافة إلى ضبط حجم ولزوجة المحلول ، في الحد من الارتجاع وضمان الجرعات الدقيقة.
   10. قم بإزالة إبرة التزقيم بعناية من معدة الفأر والمريء وأعد الفأر إلى القفص. تأكد من أن الفأر يتنفس ويتحرك بشكل طبيعي بعد التزقيم للتأكد من إدخال إبرة التزقيم بشكل صحيح طوال الإجراء وعدم استنشاق أي محلول.

< p class = "jove_content" > الجدول 1. قائمة الكواشف. الموصوفة هي الكواشف اللازمة لصنع كل من الحلول ووسائط الخميرة والألواح والمخازن المؤقتة للتحويل المستخدمة للبروتوكولات الموجودة في هذه المخطوطة.

محاليل وسائط الخميرة والأطباق كواشف التحويل البولي إيثيلين جلايكول (PEG) 50٪: YPD: TE / LiOAc: 250 جرام PEG 3350 20 جرام ببتون 50 مل 10x TE 500 مل ماء معقم 20 جرام سكر العنب 50 مل 10x (1 متر) LiOAc فلتر معقم 10 غرام من مستخلص الخميرة 400 مل ماء معقم 1 لتر ماء فلتر معقم الأوتوكلاف TE 10x: لوحات YPD: PEG / TE / LiOAc: 100 ملي تريس 20 جرام ببتون 400 مل 50٪ PEG 10 ملي EDTA 20 جرام سكر العنب 50 مل 10x TE درجة الحموضة إلى 7.5 وتعقيم المرشح 20 جرام أجار 50 مل 10x (1 متر) LiOAc 10 غرام من مستخلص الخميرة 1 لتر ماء الأوتوكلاف 20٪ جلوكوز: اليوراسيل ^- الوسائط الانتقائية الحمض النووي الناقل (SS DNA): 200 جرام سكر العنب 2 جرام مزيج من الأحماض الأمينية التي تفتقر إلى اليوراسيل يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية وقبل الاستخدام يسخن لمدة 1-2 دقيقة عند 100 درجة مئوية لإذابة الخيوط وتخزينها على الثلج 1 لتر ماء 6.7 جرام قاعدة نيتروجين خميرة بدون أحماض أمينية فلتر معقم 1 لتر ماء التعقيم عن طريق التعقيم أو الترشيح المعقم أضف 20٪ جلوكوز 1:10 قبل الاستخدام 50٪ جلسرين: اليوراسيل ^- لوحات: مخزن مؤقت للتثقيب الكهربائي: 500 مل جلسرين في قارورة 250 مل: 1 م سوربيتول 500 مل ماء 2 جرام مزيج من الأحماض الأمينية التي تفتقر إلى اليوراسيل 1 ملي كلوريد_{التيجيد 2} الأوتوكلاف 6.7 جرام قاعدة نيتروجين خميرة بدون أحماض أمينية املأ بالماء المقطر 150 مل ماء الأوتوكلاف وتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية في قارورة سعة 2 لتر: 20 جرام أجار 750 مل ماء قوارير الأوتوكلاف بشكل منفصل ، ثم تخلط مع 100 مل 20٪ جلوكوز IMDM كاملة 5-FOA ⁺: LiOAc / DTT 500 مل وسائط Dulbecco المعدلة من Iscove الأوتوكلاف في قارورة سعة 2 لتر: 0.1 م LiOAc 5 مل بنسلين ستربتومايسين جلوتامين 100x 20 جرام أجار 10 ملي ديت 500 ميكرولتر 2-ميركابتو إيثانول 750 مل ماء 10٪ مصل بقري جنين معطل بالحرارة خلط: 2.5 مل بيروفات الصوديوم 100 ملي 6.7 جرام قاعدة نيتروجين خميرة بدون أحماض أمينية 2 جرام مزيج من الأحماض الأمينية بدون يوراسيل 150 مل ماء دافئ عندما تبرد ، أضف: 0.05 جرام مسحوق يوراسيل 1 جم 5-FOA يقلب ويصفى وتعقيم أضف إلى محلول أجار المعقم تخلط مع 100 مل 20٪ جلوكوز

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1. مستعمرات الخميرة المزروعة على وسائط YPD. مثال على لوحة YPD تظهر وحدات تشكيل مستعمرة قابلة للحياة (CFU) من خميرة البروبيوتيك بعد الأشعة فوق البنفسجية. تم تخفيف الخلايا بشكل متسلسل بحيث يمكن تمييز CFU الفردية وحسابها.

الشكل 2. منحنى البقاء على...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مقياس الطيف الضوئي SmartSpec 3000 بيورراد 170-2501 مثال على مقياس الطيف الضوئي لتحديد تركيز الخلايا و OD600 لمزارع الخميرة نيو برونزويك الأسطوانة طبل إيبندورف M1053-4004 مثال على أسطوانة الأسطوانة لحضانة ثقافة الخميرة الأشعة فوق البنفسجية ستراتالينكر 2400 ستراتاجين 400075-03 مثال على stratalinker ستيوارت كولوني كاونتر SC6PLUS 11983044 فيشر ساينتيك لوحة حامل مع تكبير سجلات المستعمرة العد على استشعار الضغط من القلم عداد مستعمرة العلوم F378620002 بيل آرت ساينسوير القلم المضاد للمستعمرة باليد جهاز طلاء طبق الأصل فيشربراند 09-718-1 مثال على حامل الطلاء والوسادات المتماثلة مربعات Velveteen فيشربراند 09-718-2 موزعات الخلايا المعقمة على شكل حرف L فيشربراند 14665230 حمض الديوكسي ريبونوكلييك ، تقطعت بهم السبل من خصيتي السلمون سيجما ألدريتش D7656-1ML مثال على الحمض النووي الحامل لتحويل الخميرة LiOAc إبر التزقيم برينتري العلمية ن-بي كي 002 بالنسبة للفئران التي يتراوح وزنها بين 15 و 20 جم ، فإن الإبرة المقترحة عبارة عن مقياس 22 (كرة 1.25 مم) ، و 1 في إبرة تزقيم طويلة ومستقيمة قابلة لإعادة الاستخدام. بالنسبة للفئران التي يزيد وزنها عن 20 جراما ، يمكن استخدام إبر تزقيم مستقيمة أو منحنية قياس 20 أو أكبر 1 مل معقمة زلة طرف حقنة درنة يمكن التخلص منها بيكتون ديكنسون 309659 دينار بحريني ملقط غير حاد مثل Electron Microscopy Sciences 7 "(178 مم) طرف مسنن ، ملقط واسع المقبض علوم المجهر الإلكتروني 77937-28 مثال على الملقط الحاد اللازم للتشريح مقص تشريح مستقيم ومنحني علوم المجهر الإلكتروني 72966-02 و 72966-03 أمثلة على المقص اللازم للتشريح