توليد العدلات المرتبطة بالورم المضادة للأوعية الدموية

الملخص

المصدر: Pylaeva، E.، et al. نقل العدلات المرتبطة بالورم التي تم التلاعب بها إلى الفئران الحاملة للورم لدراسة إمكاناتها الوعائية في الجسم الحي. J. Vis. Exp. (2019).

يوضح هذا الفيديو فحصا لتوليد العدلات المرتبطة بالورم المضادة للأوعية الدموية (TANs). عند أخذ ورم الورم الميلانيني الفأري الذي يحتوي على TANs المؤيدة للأوعية الدموية ، يتم عزل الخلايا المفردة باستخدام فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) ومعالجتها بمثبط نيكوتيناميد فوسفوريبوزيل ترانسفيراز (NAMPT) لتقليل القدرة على تحفيز تكوين الأوعية.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

ملاحظة: يظهر المخطط العام للبروتوكول في الشكل 1.

فئة

1. تحضير خط خلايا الورم الميلانيني B16F10

1. قم بإعداد الخلايا السالبة للميكوبلازما المزروعة إلى طبقة أحادية التقاء بنسبة 90٪ (حوالي 10 × 10⁶ خلايا / قارورة T75) في وسط Dulbecco المعدل الكامل من Iscove (IMDMc: IMDM + 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) + 1٪ بنسلين ستربتومايسين).
2. قم بإزالة الوسط ، واشطف الخلايا بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). ضع 6 مل من محلول انفصال الخلية الذي يحتوي على إنزيمات محللة للبروتين وتحلل الكولاجين (انظر جدول المواد) ، واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين.
3. اطرق القارورة برفق لتعبئة الخلايا الملتصقة المتبقية من الأسفل. اجمع تعليق الخلية في أنابيب سعة 15 مل وأجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 7 دقائق و 20 درجة مئوية.
4. قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات جيدا في 1 مل من PBS. أضف 14 مل من PBS وأجهزة الطرد المركزي (300 × جم و 20 درجة مئوية لمدة 7 دقائق).
5. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الحبيبات في 1 مل من PBS.
6. عد الخلايا ، وأعد تعليقها إلى تركيز 3 × 10⁶ / مل PBS (للخطوة 2) أو 6 × 10⁶ / مل PBS (للخطوة 6) للحقن. احتفظ بالخلايا على الجليد لمدة أقصاها 30 دقيقة.

< p class = "jove_title" >2. نموذج الورم الخيفي في الفئران

1. استخدم 10 إناث من الفئران Ifnar1 - / - التي تتراوح أعمارها بين 8 و 12 أسبوعا والتي يتم الاحتفاظ بها في ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض (SPF).
   ملاحظه: يفضل إناث الفئران في نموذج تحت الجلد لنمو الورم ، لأن الذكور أكثر عدوانية وبالتالي عرضة لمخالفات موقع الورم ، مما يؤثر على نمو الورم.
2. احلق جلد الفأر على الجناح باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية ، وقم بتطهير الجلد بأنسجة مبللة بنسبة 70٪ من الإيثانول.
3. اجمع خلايا الورم الميلانيني B16F10 المحضرة بتركيز 3 × 10⁶ / مل PBS (انظر الخطوة 1) في حقنة 1 مل وإبرة 0.4 × 19 مم. حقن 100 ميكرولتر من المعلق تحت الجلد.
   1. امزج الخلايا جيدا قبل كل حقنة. استخدم إبرا لا يقل قطرها عن 0.4 مم حتى لا تزعج الخلايا السرطانية.
4. ضع ما يصل إلى 5 فئران في قفص واحد ، وتحكم في حجم الورم (الطول والعرض والعمق) باستخدام الفرجار لمدة 14 يوما.
   ملاحظه: وفقا للوائح الحيوانية ، يجب ألا يتجاوز حجم الورم 15 مم في القطر ، ويجب التضحية بالفئران ذات الأورام الأكبر أو النخرية / المفتوحة مسبقا.
5. في اليوم 14 ، ضحي بالفئران في غرفة ثاني أكسيد الكربون₂.
6. تطهير الجلد بنسبة 70٪ من الإيثانول وإزالة الأورام بالمقص والملقط في طبق بتري معقم. احتفظ بالأورام في أنبوب سعة 50 مل في وسط النسر المعدل الكامل من Dulbecco (DMEMc: DMEM + 10٪ FBS + 1٪ بنسلين ستربتومايسين) على الجليد.

3. عزل TAN

1. ضع الأورام في ألواح معقمة من 6 آبار ، 5 أورام لكل بئر. قطع الأورام إلى قطع 2-3 مم بمقص معقم.
   1. هضم ب 1 مل من محلول ديبسيز / كولاجيناز D / DNase I (0.2 مجم / 0.2 مجم / 100 مجم في 1 مل من DMEMc) لكل ورم. احتضن عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ في حاضنة رطبة ، واخلطها مع حقنة 10 مل بدون إبرة كل 15 دقيقة 3 مرات.
2. لإزالة الألياف غير المهضومة ، قم بربط الخلايا من خلال مرشحات 100 ميكرومتر إلى أنابيب سعة 15 مل (بئر واحد لكل مرشح لكل أنبوب). أضف PBS إلى 15 مل ، وأنابيب الطرد المركزي عند 460 × جم ، و 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق ، وقم بإزالة المادة الطافية.
3. ليز كريات الدم الحمراء مع محلول تحلل (NH₄Cl 150 mM ، KHCO₃ 10 mM ، EDTA 0.1 ملي مولار ، درجة الحموضة 7.3 ، 20 درجة مئوية) عن طريق إضافة 1 مل في كل أنبوب. تخلط جيدا ، وتمزج المحلول من جميع الأنابيب في أنبوب واحد. أوقف التفاعل بعد دقيقتين باستخدام 11 مل من DMEMc المثلج البارد (4 درجات مئوية).
4. جهاز طرد مركزي عند 460 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق ، وإزالة المادة الطافية. أعد تعليق الحبيبات ب 15 مل من PBS البارد. جهاز طرد مركزي عند 460 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق ، وإزالة المادة الطافية.
5. أعد تعليق الحبيبات في 1 مل من PBS. أضف 3 ميكرولتر من الأجسام المضادة لكتلة FC (CD16 / CD32 ، مخزون 0.5 مجم / مل) ، واحتضنه على الجليد لمدة 15 دقيقة.
6. أضف الأجسام المضادة: 10 ميكرولتر من Ly6G-phycoerythrin (Ly6G-PE ، مخزون 0.2 مجم / مل) و 10 ميكرولتر من CD11b-allophycocyanin (CD11b-APC ، مخزون 0.2 مجم / مل). أضف 20 ميكرولتر من صبغة صلاحية 6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI ، مخزون 5 مجم / مل) واحتضن على الجليد في الظلام لمدة 30 دقيقة
   ملاحظه: يمكن استخدام مزيج آخر من أصباغ البقاء ومقترنات الفلورسنت للأجسام المضادة.
7. أضف PBS حتى 15 مل ، وجهاز طرد مركزي عند 460 × جم ، و 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق ، وقم بإزالة المادة الطافية.
8. أعد تعليق الحبيبات في DMEMc إلى تركيز حوالي 10 × 10⁶ / مل ، واستمر في وضع الثلج.
9. قم بفرز العدلات CD11b ⁺ Ly6G^حية (سلبية DAPI) باستخدام فارز الخلايا المنشط بالفلورة (استراتيجية البوابات انظر الشكل 2).
   ملاحظه: احتفظ بالأنبوب مع تعليق الخلية والأنبوب مع DMEMc للخلايا التي تم فرزها عند 4 درجات مئوية. استخدم إعدادات الفرز المثلى التالية: فوهة 70 ميكرومتر ، ومعدل عتبة 22,000 حدث / ثانية كحد أقصى ومعدل تدفق 1-3.
10. تحقق من نقاء العدلات التي تم فرزها باستخدام مقياس الخلوي للحصول على نقاء موصى به يبلغ >95٪.
تقوم
11. أجهزة الطرد المركزي بفرز العدلات عند 460 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق ، وإزالة المادة الطافية. أعد تعليق الخلايا التي تم فرزها في DMEMc إلى تركيز 1 × 10⁶ / مل < br / > ملاحظه: العدد المتوقع من العدلات في ورم B16F10 لمدة 14 يوما (قطر 10 مم) هو حوالي 3 × 10⁴ خلايا.

فئة

4. تثبيط NAMPT في TAN في المختبر

1. تحضير مخزون FK866 (مثبط AMPT) في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) بتركيز نهائي قدره 100 ملي مولار.
2. مصنفة البذور العدلات (الخطوة 3.11) في بئرين من صفيحة قاع U ذات 96 بئر (1.5 × 10⁵ عدلات / بئر). أضف FK866 إلى بئر التدخل (التركيز النهائي 100 نانومتر) ، وكمية متساوية من DMEMc مع DMSO في بئر التحكم. احتضان لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ في حاضنة رطبة.
3. جهاز طرد مركزي عند 460 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق ، وإزالة المادة الطافية. أعد تعليقها في 200 ميكرولتر من PBS في كل بئر. كرر 2 مرات.
4. جهاز طرد مركزي عند 460 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق ، وإزالة المادة الطافية. يعاد تعليقه في وسط نمو الخلايا البطانية التجارية (مكمل 4 ميكرولتر / مل مكمل نمو الخلايا البطانية ، 0.1 نانوغرام / مل عامل نمو البشرة البشري المؤتلف ، 1 نانوغرام / مل عامل نمو الخلايا الليفية البشرية الأساسية المؤتلف ، 90 ميكروغرام / مل من الهيبارين و 1 ميكروغرام / مل هيدروكورتيزون) إلى تركيز نهائي قدره 0.2 × 106 خلية / مل (في 0.75 مل) (للخطوة 5) أو في PBS إلى التركيز النهائي 0.6 × 10⁶ خلايا / مل ( في 0.25 مل).

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1. مخطط البروتوكول. الخطوة 1. تحضير خط خلايا الورم الميلانيني B16F10 ؛ 2. نموذج الورم الخيفي في الفئران. 3. عزل TANs عن الأورام. 4. تثبيط NAMPT في TANs في المختبر. 5. تقدير الخصائص الوعائية ل TANs في مقايسة الحلقة الأبهري. 6. النقل بالتبني للعدلات المعالجة في نموذج الورم الخيفي. 7. مراقبة نمو الورم ، الفحص النسيجي.

< p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1"...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات أنابيب 15 مل Sarstedt AG & Co., Nümbrichht, ألمانيا 6,25,54,502 أنابيب 50 مل Celltar ، Greiner Bio One International GmbH ، Frickenhausen ، ألمانيا 227261 5 مل / 10 مل / 25 مل أطراف معقمة للماصة الأوتوماتيكية Celltar ، Greiner Bio One International GmbH ، Frickenhausen ، ألمانيا 6006180 / 607180 / 760180 6 ألواح ثقافة خلية مسطحة القاع جيدا Sarstedt AG & Co., Nümbrichht, ألمانيا 8,33,920 96 لوحة ثقافة خلية مسطحة القاع جيدا Celltar ، Greiner Bio One International GmbH ، Frickenhausen ، ألمانيا 655180 96 لوحة ثقافة خلية قاع على شكل حرف U Celltar ، Greiner Bio One International GmbH ، Frickenhausen ، ألمانيا 65018 مضاد للفأر CD11b بي دي فارميجن، بيكتون ديكنسون، فرانكلين ليكس، الولايات المتحدة 553312 استنساخ M1 / 70 ، مترافق مع APC ، 0.2 مجم / مل مضاد للفأر Ly6G BioLegend ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة 127608 استنساخ 1A8 ، مترافق ب PE ، 0.2 مجم / مل BD FACS AriaII BD Biosciences، بيكتون ديكنسون، فرانكلين ليكس، الولايات المتحدة فارز الخلايا الفرجار فوغل ألمانيا ، كيفلر، ألمانيا عداد خلية كاسي Innovatis ، روش إنوفاتيس إيه جي ، بيليفيلد ، ألمانيا مرشحات معقمة Trics 50 ميكرومتر / 100 ميكرومتر Sysmex Partec GmbH ، Goerlitz ، ألمانيا 04-004-2327 / 04-004-2328 جهاز طرد مركزي روتينا 420 آر أندرياس هيتيتش ، توتلينغن ، ألمانيا 4706 كولاجيناز د سيجما ألدريتش / ميرك ، دارمشتات ، ألمانيا 11088858001 DAPI (4 '، 6-Diamidino-2-Phenylindole، Dilactate) BioLegend ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة 422801 مخزون: 5 ملغ / مل الاختلاف الأول سيجما ألدريتش / ميرك ، دارمشتات ، ألمانيا د4818-2 ملغ DMEM جيبكو ، لايف تكنولوجيز / ثيرمو فيشر العلمية ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة 41966-029 DMEM كامل: DMEM + 10٪ FBS + 1٪ بنسلين ستربتومايسين DMSO (ثنائي ميثيل سوفوكسيد) WAK-Chemie Medical GmbH ، شتاينباخ ، ألمانيا واك - DMSO - 10 CryoSure-DMSO DNase I سيجما ألدريتش / ميرك ، دارمشتات ، ألمانيا DN25-100 ملغ DPBS جيبكو ، لايف تكنولوجيز / ثيرمو فيشر العلمية ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة 14190-094 وسط نمو الخلايا البطانية PromoCell ، هايدلبرغ ، ألمانيا ج -22010 FBS (مصل الأبقار الجنينية) Biochrom ، برلين ، ألمانيا S0115 كتلة FC (مضادة للماوس CD16 / 32) بي دي فارمينجن، بيكتون ديكنسون، بيكتون ديكنسون، فرانكلين ليكس، الولايات المتحدة 553142 استنساخ 2.4G2 ، المخزون: 0.5 مجم / مل FK 866 هيدروكلوريد Axon Medchem ، جرونينجن ، هولندا محور عصبي 1546 مخزون: 100 ملم الماعز المضادة للأرانب IgG H&L أبكام ، كامبريدج ، المملكة المتحدة أب97075 Cy3 مترافق ، مخزون: 0.5 مجم / مل حاضنة Heracell 240i CO2 ثيرمو فيشر العلمي ، والثام ، الولايات المتحدة 51026334 IMDM جيبكو ، لايف تكنولوجيز / ثيرمو فيشر العلمية ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة هاتف: 12440-053 IMDM كامل: IMDM + 10٪ FBS + 1٪ بنسلين ستربتومايسين ماكينة حلاقة Isis GT420 براون أسكولاب ، سوهل ، ألمانيا 90200714 Matrigel Matrix غشاء القاعدي كورنينج لعلوم الحياة ، أمستردام ، هولندا 7205011 أحادي النسيلة مضاد للأكتين ، α العضلات الملساء سيجما ألدريتش / ميرك ، دارمشتات ، ألمانيا F3777 مترافق FITC ، لا توجد معلومات حول تركيز المخزون الإبر 0.4 مم × 16 مم بي دي ميكرولانس ، بيكتون ديكسون ، بيكتون ديكنسون ، فرانكلين ليكس ، الولايات المتحدة 302200 نيوماونت ميرك ، دارمشتات ، ألمانيا HX67590916 مصل الماعز العادي مختبرات جاكسون للأبحاث المناعية ، ويست جروف ، الولايات المتحدة 005-000-121 البنسلين ستربتومايسين جيبكو ، لايف تكنولوجيز / ثيرمو فيشر العلمية ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة 15140-122 ماصة بيبيتوس الأوتوماتيكية Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt, ألمانيا 9907200 حامل ProLong Gold المضاد للبهتان مع DAPI Invitrogen ، ثيرمو فيشر العلمي ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة ص36935 أرنب مكافحة الفأر Laminin جاما 1 سلسلة Immundiagnostik ، بنشيم ، ألمانيا AP1001.1 لا توجد معلومات حول تركيز المخزون StemPro Accutase جيبكو ، لايف تكنولوجيز / ثيرمو فيشر العلمية ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة أ 1105-01 مشرط التخلص المعقم (رقم 15) MedWare، نابولي، الولايات المتحدة هاتف: 120920 محاقن 1 مل بي دي بلاستيباك، بيكتون ديكنسون، فرانكلين ليكس، الولايات المتحدة 303172 محاقن 10 مل BD Discardit II ، بيكتون ديكنسون ، فرانكلين ليكس ، الولايات المتحدة 309110 قوارير زراعة الخلايا المعقمة T75 Sarstedt AG & Co., Nümbrichht, ألمانيا 83,39,11,302