تقنية اقتران أفيدين والبيوتين لتقديم المستضدات المستهدفة على المتفطرة بوفيس BCG

الملخص

المصدر: Liao ، T. A. ، et al. ، التعبير عن المستضدات الخارجية في لقاح المتفطرة بوفيس BCG عبر الزخرفة السطحية غير الجينية بنظام أفيدين البيوتين. ج. فيس إكسب. (2018).

يوضح الفيديو تقنية لتحميل المستضدات على المتفطرة بوفيس BCG لتحسين خصائصها المناعية. تستخدم الطريقة نظام أفيدين - البيوتين لتغطية السطح البكتيري بمستضدات خارجية.

البروتوكول

فئة < p = "jove_title" >1. البيوتينيل لسطح خلية BCG

1. ازرع BCG في مرق Middlebrook 7H9 مع 10٪ OADC (حمض الأوليك والألبومين ومحلول سكر العنب) و 0.05٪ Tween 80 عند 37 درجة مئوية على منصة شاكر عند 50 دورة في الدقيقة حتى OD = 0.5-1.
   ملاحظة: BCG هو أحد مسببات الأمراض من المستوى 2 للسلامة البيولوجية ويجب إجراء جميع التجارب المتعلقة ب BCG في خزانة السلامة البيولوجية مع معدات الحماية الشخصية المناسبة.
2. اغسل 10⁹ BCG 3 مرات باستخدام 500 ميكرولتر من PBS الخالي من السموم الداخلية المثلجة بالإضافة إلى 0.1٪ Tween80 (PBST) (درجة الحموضة 8.0). تعليق حبيبات BCG في PBS معقم خال من السموم الداخلية.
3. قبل الاستخدام مباشرة ، قم بإعداد 1 مل من 10 ملي مولار من البيوتين Sulfo-NHS SS في ماء مفلتر معقم.​
   1. احتضان البكتيريا ب 1 مل من 0.5 ملي مولار من بيوتين Sulfo-NHS SS في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
4. اغسل البكتيريا المسماة 3 مرات باستخدام 500 ميكرولتر من PBST البارد المثلج لإزالة كاشف البيوتينيل غير المتفاعل.
   1. أعد تعليق الحبيبات في 1 مل من PBST.

فئة

2. ربط بروتين Avidin-fusion الأحادي بسطح BCG البيوتينيل

1. امزج 5 × 10⁸ BCG البيوتينيل مع بروتين Avi (10 ميكروغرام / مل نهائي في PBS-T) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة على منصة شاكر.
2. اغسل البكتيريا 3 مرات باستخدام 500 ميكرولتر من PBST البارد المثلج.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات RPMI 1640 الخالي من السموم الداخلية تقنيات الخلايا الجذعية 36750 بيوتين Sulfo-NHS SS ثيرمو فيشر هاتف: 21328 مرق ميدلبروك 7H9 أنظمة تشخيص BD هاتف: 271310 OADC أنظمة تشخيص BD ب 11886 توين 80 سيجما ألدريتش ص 1379