اختبار لتحليل اختبار β-جلوكان كاستراتيجية علاج مناعي ضد خلايا سرطان الدماغ

الملخص

المصدر: Folgado-Dorado، C. et al. ، عزل وتنقية β الجلوكان الفطري كاستراتيجية علاج مناعي للورم الأرومي الدبقي. J. Vis. Exp. (2023)

يوضح هذا الفيديو فحصا في المختبر يستخدم β-glucans لتنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة لإنتاج جذور الأكسيد الفائق ، وهي نوع من أنواع الأكسجين التفاعلية. في خلايا سرطان الدماغ ، تثبط المؤكسدات التفاعلية المتولدة بنشاط تكاثر الخلايا السرطانية وتحفز موت الخلايا.

البروتوكول

دراسة في المختبر لتحفيز الخلايا الدبقية الصغيرة الناجم عن β الجلوكان

< p class = "jove_title" >1. زراعة الخلايا للورم الأرومي الدبقي للفأر والخلايا الدبقية الصغيرة في شرائح غرفة 8 آبار

ملاحظة: هذا البروتوكول خاص بخطوط خلايا GL261 (الورم الأرومي الدبقي) و BV2 (الخلايا الدبقية الصغيرة). ومع ذلك ، مع تعديلات طفيفة ، يمكن استخدام هذه الخطوات لدراسة خطوط الخلايا السرطانية والمناعية الأخرى.

1. قم بإعداد وسط النسر المعدل (DMEM) المعدل من Dulbecco مع L-glutamin ، 4.5 جم / لتر D-glucose ، وبدون بيروفات. أضف 10٪ من مصل الأبقار الجنيني (FBS) و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين. قم بتسخين المادة مسبقا في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
2. قم بإذابة BV2 و GL261 المجمدة في حمام مائي (37 درجة مئوية) لمدة دقيقتين ، وقبل أن تذوب تماما ، احملها إلى غطاء تدفق رقائقي وقم بتقطيع الخلايا إلى قارورتين معقمتين مختلفتين T25 (واحدة لكل خط خلية).
3. احتضان قوارير T25 عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ حتى تتماسك المزرعة.
   ملاحظه: اعتمادا على ظروف التجميد والوقت الذي يخضع للحفظ بالتبريد، قد يختلف الوقت حتى التقاء. تتطلب خطوط الخلايا هذه عادة ما بين 3 إلى 5 أيام للوصول إلى التقاء في قارورة T75.
4. بعد أن تصبح ثقافة خلية BV2 ملتقية ، انقلها إلى شرائح غرفة 8 آبار 0.6 × 10⁶ خلايا / بئر. احتفظ بشرائح الغرفة المكونة من 8 آبار في الحاضنة لمدة 24 ساعة.
5. بمجرد طلاء الخلايا الدبقية الصغيرة في شرائح الغرفة المكونة من 8 آبار ، كرر نفس البروتوكول مع خلايا GL261.

2. تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة باستخدام β-glucans

1. قم بتغطية خلايا BV2 بأربعة خلايا مختلفة من β-جلوكان (P. ostreatus و P. djamor و G. lucidum و H. erinaceus) بتركيز 0.2 مجم / مل لمدة 72 ساعة. يجب أن تظل حالة تجريبية واحدة غير معالجة (وسط طبيعي) ، تعمل كمجموعة ضابطة.
2. اجمع المادة الطافية بماصة بعد 72 ساعة وقم بتمرير الحجم المتبقي عبر مرشح حقنة 0.20 ميكرومتر. ثم قم بتجميد المادة الطافية عند -80 درجة مئوية لمدة 24 ساعة على الأقل.

فئة

3. علاج GL261 بوسط مكيف للخلايا الدبقية الصغيرة المنشط مسبقا

1. بمجرد أن يلتقي GL261 بنسبة 80٪ داخل شرائح الغرفة المكونة من 8 آبار ، أضف وسط دبلي صغير معالج ب β جلوكان بتركيز حجم نهائي قدره 25٪ لمدة 72 ساعة (الحجم الإجمالي: 250 ميكرولتر / بئر).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات شرائح غرفة 8 آبار ثيرمو فيشر ، الولايات المتحدة الأمريكية هاتف: 171080 وسط النسر المعدل من Dulbecco ، Gluta MAXTM جيبكو ، لايف تكنولوجيز ، كارلسباد ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية 10564011 إكستندا (α- الأميليز / جلوكو أميليز) نوفوزيميس ، الدنمارك مصل الأبقار الجنينية جيبكو ، لايف تكنولوجيز ، كارلسباد ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية A4736301 محلول ملحي مخزن بالفوسفات جيبكو ، لايف تكنولوجيز ، كارلسباد ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية 1010-015 البنسلين / الستربتومايسين سيجما ألدريتش ، سانت لويس ص 4458 حاضنه إيبدورف جالاكسي 170 إس