طريقة لمعالجة الخلايا المتغصنة بالملح العالي ونقلها بالتبني إلى الفئران

الملخص

المصدر: Van Beusecum ، J. P. ، et al. عزل ونقل بالتبني للخلايا المتغصنة العارضة للمستضد المعالجة بالملح عالي الملح. J. Vis. Exp. (2019).

يوضح هذا الفيديو إجراء للنقل المتبنى للخلايا المتغصنة العارضة للمستضد المعالجة بالملح (DCs) إلى الفئران. تتعرض الخلايا المتغصنة في الفئران CD11c + (DCs) لوسط يحتوي على كميات عالية من الصوديوم ، مما يشكل مقاربات بروتين isolevuglandin (IsoLG) في الخلايا. تعمل هذه المقاربات كمستضدات جديدة ويتم تقديمها على سطح التيار المستمر. يتم حقن الخلايا المعالجة بالملح العالية في الفئران من خلال نقل الخلايا بالتبني.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. عزل الطحال عن الفئران

1. تحضير 1640 RPMI (معهد روزويل بارك التذكاري): 10٪ مصل بقري للجنين (FBS) ، 0.10 ملي مولار 4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبرازينيثان سلفونيك (HEPES) ، 1 ملي مولار بيروفات الصوديوم ، 50 ميكرومتر β-ميركابتو إيثانول و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين.
2. قتل الفئران الذكور C57bl / 6 البالغة من العمر 10-12 أسبوعا عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون₂. رش صدر وجوانب الماوس بنسبة 70٪ من الإيثانول. على الجانب الأيسر ، افتح الجلد والتجويف البريتوني بعناية لفضح الطحال.
3. باستخدام ملقط صغير ، حرك الأمعاء والكبد بحذر إلى الجانب الأيسر من الفأر ، وباستخدام مقص ناعم ، استئصال الطحال برفق.
   ملاحظه: يجب أن تتم هذه الخطوة بعناية فائقة ، لأن تلف الجهاز الهضمي يمكن أن يؤدي إلى التلوث.
4. ضع كل طحال مستأصل في أنبوب مخروطي الشكل سعة 15 مل يحتوي على 3 مل من وسط RPMI 1640.

< p class = "jove_title" >2. توليد معلقات خلية واحدة من الطحال

ملاحظة: يمكن فصل الطحال إلى معلق أحادي الخلية من خلال الجمع بين التفكك الميكانيكي والهضم الأنزيمي.

1. تحضير محلول هضم الطحال عن طريق إضافة الكولاجيناز D (1 مجم / مل ؛ 0.29 وحدة / مجم مجفف بالتجميد) و DNase I (0.1 مجم / مل) إلى وسط RPMI 1640 المحضر (انظر الخطوة 1.1)
2. استخدم ملقطا لنقل الطحال إلى أنبوب C (أنبوب تفكك) يحتوي على 3 مل من محلول هضم الطحال.
3. قم بإجراء التفكك الميكانيكي باستخدام الخالط شبه الآلي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
   1. ضع الأنبوب C على الخالط شبه الآلي ، مع التأكد من وضع الأنبوب C بإحكام على الذراع الدوار. بمجرد وضع الأنبوب C ، اضغط على زر البدء في الخالط شبه الآلي لتشغيل بروتوكول Spleen 04.01 لمدة 60 ثانية < / > ملاحظة: يمكن أيضا إجراء التفكك الميكانيكي عن طريق وضع مرشح 40 ميكرومتر فوق أنبوب مخروطي سعة 50 مل وطحن الطحال برفق من خلال الفلتر. بعد طحن الطحال ، اشطف مرشح 40 ميكرومتر ب 10 مل من وسائط RPMI.
4. بعد التفكك الميكانيكي ، افصل الأنبوب عن الخالط وقم بإجراء الهضم الأنزيمي. احتضان العينات لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية تحت الدوران المستمر (20 دورة في الدقيقة).
5. انقل المحلول عن طريق سحب العينات إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل بعد الترشيح من خلال مصفاة 40 ميكرومتر. اغسل المصفاة 40 ميكرومتر ب 10 مل من Dulbecco's PBS (dPBS). الطرد المركزي للخلايا عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
6. بعد الطرد المركزي ، قم بشفط المادة الطافية تماما واغسل الحبيبات عن طريق تعليقها في 10 مل من dPBS. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.

فئة

3. عزل CD11c ⁺ DCs عن تعليق الخلية المفردة الطحالية

1. أعد تعليق حبيبات الخلية في 5 مل من dPBS واحسب عدد الخلايا باستخدام مقياس الدم واستبعاد التريبان الأزرق.
2. قم بتكسير الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 300 × جم ، لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
3. شفط المادة الطافية تماما وأعد تعليق الحبيبات في 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت لفرز الخلايا المنشط مغناطيسيا (MACs).
4. أضف 100 ميكرولتر من حبيبات CD11c الدقيقة (انظر جدول المواد) لكل 1 × 10⁸ خلايا.
قم
5. بتدوير تعليق الخلية واحتضانها لمدة 10 دقائق في الثلاجة عند 4 درجات مئوية.
6. أضف 10 مل من المخزن المؤقت MACs لغسل الخلايا. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
7. قم بشفط المادة الطافية تماما وأعد تعليقها في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت MAC.

< p class = "jove_title" >4. الفصل المغناطيسي ل CD11c ⁺ DCs

ملاحظة: يتم الفصل المغناطيسي يدويا باستخدام فاصل مغناطيسي (انظر جدول المواد) مزود بأعمدة LS. يمكن أيضا إجراء الفصل المغناطيسي تلقائيا باستخدام فاصل مغناطيسي آلي. (انظر جدول المواد).

1. ضع عمود LS في المجال المغناطيسي لفاصل MACs وأنبوب مخروطي 15 مل أسفل كل عمود لتجميع التدفق.
2. اشطف عمود LS ب 3 مل من المخزن المؤقت.
3. ضع تعليق الخلية على كل عمود LS واجمع التدفق الذي يحتوي على خلايا غير مصنفة.
4. اغسل عمود LS ب 3 مل من المخزن المؤقت MACs ، واجمع الخلايا غير المسماة التي تمر عبرها. اغسل عمود LS 2 مرات أخرى.
5. قم بإزالة عمود LS من الفاصل المغناطيسي. أضف 5 مل من المخزن المؤقت MACs إلى كل عمود وقم على الفور بإخراج الخلايا المصنفة مغناطيسيا عن طريق غمر عمود LS بإحكام في أنبوب مخروطي نظيف سعة 15 مل.
   ملاحظه: من المهم إجراء عزل مزدوج لخلايا CD11c للحصول على تعليق خلوي عالي النقاء. لذلك ، كرر الخطوات من 3.1 إلى 4.5. والشكل المرجعي 4 لمعايير النقاء. تعمل هذه الخطوة على تحسين نقاء خلايا CD11c ⁺ إلى 90-95٪.
6. حدد رقم CD11c ⁺ DC على مقياس كثافة الدم باستخدام استبعاد التريبان الأزرق. خفف عينة الخلية عند تخفيف 1: 1 في محلول تريبان أزرق 0.4٪.
   ملاحظة: سيتم تلطيخ الخلايا غير القابلة للحياة باللون الأزرق ، بينما ستبقى الخلايا القابلة للحياة غير ملطخة.
   1. للقيام بذلك ، املأ بعناية مقياس الدم ب 10 ميكرولتر من تخفيف عينة الخلية واحتضانه لمدة 1 دقيقة.
   2. عد الخلايا في 4 مربعات بحجم 1 × 1 مم² في الغرفة التي تم تحميلها لتحديد رقم الخلية القابل للحياة.

فئة

5. المعالجة العالية بالملح في المختبر ل CD11c ⁺ DCs

1. تحضير وسط استزراع التيار المستمر بإضافة 10٪ FBS، 0.1 ملي هيبيس، 1 ملي مولار بيروفات الصوديوم، 50 ميكرومولار β-ميركابتو إيثانول و1٪ بنسلين/ستربتومايسين إلى 500 مل 1640 دورة في الدقيقة.
2. قم بإعداد وسائط زراعة خلايا الملح العالية 10x DC (400 ملليمتر) عن طريق وزن 1.17 جم من كلوريد الصوديوم ووضعها في أنبوب صقر معقم سعة 50 مل. أضف 50 مل من وسائط زراعة خلايا التيار المستمر المعقمة (المحضرة في الخطوة 5.1) إلى أنبوب الصقر والدوامة سعة 50 مل حتى يصبح كلوريد الصوديوم في المحلول.
3. قم بتصفية وسائط ثقافة التيار المستمر عالية الملح على الفور باستخدام الترشيح الفراغي من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر في غطاء زراعة الخلايا.
4. جهاز طرد مركزي كل معلق خلية من الطحال عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق كل حبيبات خلية في وسط زراعة التيار المستمر بتركيز 1 × 10⁶ خلايا / مل.
5. الماصة 900 ميكرولتر (حوالي 1 × 10⁶ خلايا) من نظام التعليق DC في صفيحة فالكون ذات قاع مسطح 24 بئرا. أضف 100 ميكرولتر من وسائط ثقافة التيار المستمر عالية الملح إلى كل بئر للحصول على تركيز نهائي من الصوديوم يبلغ 190 مليمتر. قم بتسمية اللوحة وضعها في حاضنة ثاني أكسيد الكربون_{المرطبة 37} درجة مئوية لمدة 48 ساعة.

< p class = "jove_title" >6. النقل بالتبني ل CD11c ⁺ DCs المعالجة بالملح

العالية

1. بعد التحفيز في المختبر لمدة 48 ساعة ، قم بإزالة اللوحة من حاضنة ثاني أكسيد الكربون_{المرطبة 37} درجة مئوية.
2. ماصة وسائط زراعة الخلية لأعلى ولأسفل لإعادة تعليق CD11c ⁺ DCs. ماصة كل تعليق CD11c ⁺ DC في أنبوب 1.6 مل المقابل. كرر هذه الخطوة لكل فرد مطلي جيدا.
3. جهاز طرد مركزي لكل تعليق CD11c ⁺ DC عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق حبيبات التيار المستمر ب 100 ميكرولتر من dPBS المعقم.
4. اسحب تعليق التيار المستمر في حقنة سعة 1 مل مزودة بإبرة 27 جم 1/2 بوصة.
5. ضع الفئران الذكرية الساذجة C57bl / 6 البالغة من العمر 10 أسابيع تحت 2٪ من الأيزوفلوران لتحقيق مستوى جراحي مستقر. تحقق من مستوى التخدير مع عدم وجود منعكس الدواسة. بمجرد تحقيق مستوى جراحي مستقر ، أدخل الإبرة ببطء وحذر في الفضاء المداري الرجعي بزاوية حوالي 30 درجة .
   ملاحظه: يجب أن يكون شطبة الإبرة 27 G متجهة لأسفل ، بعيدا عن العين ، لمنع تلف العين.
قم
6. بحقن نظام التعليق CD11c ⁺ DC ببطء وسلاسة (حوالي 1 × 10⁶ خلايا). بمجرد اكتمال الحقن ، قم بإزالة الإبرة بعناية من الفضاء المداري الرجعي مع الوعي بعدم إتلاف العين><. ملاحظه: بعد الحقن ، يجب أن يكون هناك نزيف قليل أو معدوم. يمكن أيضا إجراء النقل بالتبني ل CD11c ⁺ DCs باستخدام طريقة الحقن IV (مثل الوريد الذيل). تلقت الفئران الضابطة CD11c ⁺ DCs التي تم زراعتها في وسط الملح العادي.
7. قم بإزالة الفئران من مخروط الأنف وراقبها لمدة 30 دقيقة تقريبا أثناء التعافي من التخدير.

المواد