تصوير خلايا بيتا المعدلة وراثيا في فأر يعاني من نقص المناعة ويواجه تحديا لخلايا الطحال السكرية

الملخص

المصدر: Stewart، T. et al.، مراقبة الإضاءة الحيوية لبقاء الكسب غير المشروع في نموذج نقل بالتبني لمرض السكري المناعي الذاتي في الفئران.J. Vis. Exp. (2022)

يوضح هذا الفيديو طريقة قائمة على التصوير لتصور خلايا بيتا المزروعة التي تعبر عن اللوسيفيراز في فأر يعاني من نقص المناعة السكري غير المفرط. يؤدي إدخال خلايا الطحال من الفأر المصاب بالسكري إلى تدمير خلايا بيتا التدريجي ، والذي تم تأكيده بصريا من خلال انخفاض اللمعان بعد إدخال الركيزة.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. هندسة وصيانة خطوط خلايا NIT-1

1. الحفاظ على خطوط خلايا NIT-1 ، التي تشترك في خلفية وراثية مع الفئران غير المصابة بالسكري (NOD) ، وخلايا 293 قدما في الأطباق المعالجة بزراعة الأنسجة في Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) التي تحتوي على 4.5 جم / لتر من الجلوكوز المكمل بمصل الأبقار الجنيني 10٪ و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
2. قم بتنمية الخلايا التي يبلغ طولها 293 قدما إلى 70٪ -80٪ من التقاء التعداد.
3. لكل طبق 10 سم من خلايا 293 قدما ، اجمع بين 10 ميكروغرام من pLenti-luciferase-blast (انظر الملف التكميلي 1) ، والذي يعبر عن الجين المعدل لوسيفيراز اليراع (luc2) تحت سيطرة محرك EF1α النشط بشكل أساسي ، 2 ميكروغرام لكل من بلازميدات التغليف pMD2.G ، pMDLg / pRRE ، و pRSV-Rev ، 4 ميكروغرام من بلازميد بروتين المغلف pCMV-VSV-G ، و 60 ميكروغرام من البولي إيثيلينيمين الخطي (PEI) في 1 مل من DMEM الخالي من المصل. اضبط الكميات بناء على عدد الخلايا المراد نقلها.
4. اترك الحمض النووي وجزيرة الأمير إدوارد و DMEM في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 20 دقيقة ، ثم أضفها إلى خلايا 293 قدما.
5. اجمع الوسط الذي يحتوي على جزيئات العدسات الفيروسية بعد 48 ساعة من التعدين.
6. قم بتحويل خلايا NIT-1 عند التقاء ~ 80٪ مع 1 مل من الوسط الذي يحتوي على جزيئات الفيروسات العدسية لكل 10⁶ خلايا لمدة 48-72 ساعة.
7. حدد الخلايا التي تعبر عن اللوسيفيراز مع 5 ميكروغرام / مل بلاستيسيدين لمدة 48 ساعة.
8. علاوة على ذلك ، قم بتعديل الخلايا التي تعبر عن اللوسيفيراز وراثيا لتناسب السؤال التجريبي. قم بتضمين خط خلية تحكم من النوع البري أو غير المستهدف الذي يعبر عن لوسيفيراز للمقارنة.
   ملاحظه: تشمل أمثلة التعديلات الجينية المستهدفة التكرارات المتجانسة القصيرة العنقودية (CRISPR) بالضربة القاضية ، و CRISPRa / i ، والضربة القاضية shRNA ، والإفراط في التعبير.

< p class = "jove_title" >2. تحضير خلايا NIT-1 للزرع

1. قم بتنمية الخلايا التي تعبر عن اللوسيفيراز حتى تصبح 80٪ -90٪ ملتقية.
2. قم بإزالة وسط النمو واغسل الخلايا بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS ، 5 مل لطبق 10 سم).
3. أضف 1 مل من 0.05٪ حمض التربسين - إيثيلين ديامين تترا أسيتيك (التربسين-EDTA) إلى كل طبق لمدة دقيقتين.
4. قم بتحييد التربسين ب 5 مل من وسط النمو.
5. استخدم ماصة لغسل الخلايا من الطبق ونقلها إلى أنبوب مخروطي الشكل.
   ملاحظه: يمكن الجمع بين الخلايا من أطباق متعددة من نفس خط الخلية.
6. عد الخلايا باستخدام بقعة مثل التريبان الأزرق يدويا باستخدام مقياس كثافة الدم أو تلقائيا باستخدام عداد الخلايا التلقائي.
7. جهاز طرد مركزي عند 250 × جم لمدة 5 دقائق عند RT وقم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة شفاقت.
8. أعد تعليق حبيبات الخلية في PBS بتركيز 5 × 10⁷ خلايا / مل (سيتم زرع 10⁷ خلايا لكل خط خلية لكل فأر بحجم 200 ميكرولتر).
9. احتفظ بالخلايا على الجليد (لمدة تصل إلى 3 ساعات) حتى الزرع.

فئة

3. زرع خلايا NIT-1 في الفئران غير البدينة المصابة بنقص المناعة المشترك السكري الشديد (NOD-scid)

1. تخدير الفئران المتلقية (الفئران NOD-scid البالغة من العمر 8-10 أسابيع من نفس جنس الفئران المستخدمة لعزل خلايا الطحال) عن طريق استنشاق الأيزوفلوران في غرفة ضربة قاضية. قم بتوصيل 2.5٪ من الأيزوفلوران إلى الغرفة بمعدل تدفق 1.5 لتر / دقيقة ومعدل إخلاء 9 لتر / دقيقة.
2. قم بتليين عيون بمرهم للعيون لمنع الجفاف.
3. باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية مع واقي ، قم بإزالة الشعر من الجزء الخلفي (الجانب الظهري) للفئران لكشف الجلد. ستكون منطقة الزرع المحلوقة حوالي 1 بوصة × 2 بوصة. أعد الفئران المحلوقة إلى غرفة الضربة القاضية حتى عملية الزرع.
4. انقل الفئران واحدة تلو الأخرى إلى سطح نظيف باستخدام مخروط أنف إيزوفلوران. قم بتوجيه رأس الفأر برفق إلى مخروط الأنف. استخدم معدل تدفق الأيزوفلوران 0.25 لتر / دقيقة للحفاظ على التخدير أثناء الزرع.
5. امسح منطقة الزرع بقطعة تحضير من كحول الأيزوبروبيل لإزالة الشعر المتساقط وتطهير الجلد.
6. تأكد من إعادة تعليق الخلايا بالكامل قبل تحميل المحقنة. ارسم حجما زائدا (>300 ميكرولتر) من الخلايا في حقنة معقمة سعة 1 مل بإبرة 26 جرام. إزالة أي فقاعات. ثم أعد الخلايا الزائدة إلى الأنبوب بحيث يبقى 300 ميكرولتر من تعليق الخلية في المحقنة.
7. باستخدام زوج من الملقط المنحني المثبت في اليد غير المهيمنة ، ارفع الجلد برفق على جانب واحد (يسار أو يمين) من ظهر الماوس للسماح بالوصول بسهولة إلى المساحة تحت الجلد.
8. باستخدام اليد المهيمنة ، ضع المحقنة موازية للمستويات الإكليلية والسهمية لجسم الفأر. مع توجيه الإبرة نحو رأس الفأر ، أدخل الإبرة في الجلد بالقرب من الخلف ووجهها برفق إلى الفضاء تحت الجلد. تأكد من بقاء الإبرة بأكملها تحت الجلد ولا تخترق.
9. اضبط الملقط لتثبيت الجلد برفق حول قاعدة الإبرة. قم بتوزيع كمية صغيرة من تعليق الخلايا ببطء (<50 ميكرولتر) وتأكد من أن انتفاخ صغير يتشكل تحت الجلد في موقع الحقن. استمر في حقن معلق الخلية حتى يتم تسليم 200 ميكرولتر إلى الفضاء تحت الجلد.
10. أمسك الملقط في مكانه والحفاظ على الإبرة موازية لجسم الفأر ، اسحب الإبرة ببطء. بعد إزالة الإبرة، أغلق الجلد بالملقط لبضع ثوان لمنع الخلايا من التسرب من الجرح البزل.
11. إذا تم تقييم التعديل الجيني ، كرر عملية الزرع على الجانب الآخر من الفأر باستخدام حقنة مختلفة بحيث يتم حقن كل من الخلايا الطافرة والخلايا الضابطة في كل فأر ، مع خط خلية واحد على اليسار والآخر على اليمين. إذا تم زرع خط خلوي واحد فقط ، فقم بحقن الخلايا على جانب واحد فقط.
12. بعد عملية الزرع ، انقل كل فأر إلى قفص جديد. اسمح لكل فأر بالتعافي تماما من التخدير قبل إضافة فئران إضافية إلى القفص.
    ملاحظه: تتعافى الفئران عندما تستأنف أنشطتها العادية ولا تظهر عليها علامات الخمول أو ضعف الحركة.
13. تقييم الحالة الصحية للفئران يوميا طوال مدة التجربة بعد الزرع. إذا شكلت الطعوم انتفاخا كبيرا أو أصبحت الفئران ضعيفة وخاملة ، فقم بقياس نسبة الجلوكوز في الدم وتوفير 10٪ (وزن / وزن) من ماء السكروز لجميع الفئران التي تعاني من نقص السكر في الدم. اتبع جميع التوصيات البيطرية وقتل أي فئران تعاني من حالة الجسم السيئة المستمرة وفقا للإرشادات المؤسسية. في هذه الدراسة ، تم القتل الرحيم للفئران عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون₂ متبوعا بخلع عنق الرحم.

< p class = "jove_title" >4. عزل وتنقية خلايا الطحال ذاتية التفاعل

1. حدد الفئران الذكور أو الإناث المصابة بمرض NOD البالغ من العمر 10-16 أسبوعا المصابة بداء السكري حديثا (أقل من 10 أيام) باستخدام شرائط اختبار الجلوكوز في البول (أو الدم). تعتبر الفئران NOD مصابة بالسكري عندما يكون لديهم ≥250 مجم / ديسيلتر في البول / الجلوكوز في الدم على الأقل يومين متتاليين. < / > ملاحظه: لكل فأر NOD-scid ، هناك حاجة إلى 10 ملايين من خلايا الطحال. ينتج الطحال الواحد عادة ما يتراوح بين 50 مليون إلى 150 مليون خلية طحال. تم عزل خلايا الطحال من الفئران الخالية من مسببات الأمراض الموجودة في منشأة خاضعة للمراقبة الخافرة.
2. القتل الرحيم للعدد المناسب من الفئران المصابة بالسكري.
   ملاحظه: في هذه الدراسة ، تم القتل الرحيم للفئران عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون₂ متبوعا بخلع عنق الرحم لضمان الوفاة.
3. مع وجود الفأر على ظهره ، قم بعمل شق عمودي يبلغ طوله حوالي 2 بوصة في الجلد باستخدام مقص جراحي. افتح الجانب الأيمن من الماوس من وجهة نظر الباحث وحدد موقع الطحال الأحمر الفاتح. اقطع الطحال برفق بعيدا عن البنكرياس الوردي وانقله إلى طبق بتري معقم مقاس 10 سم يحتوي على 5 مل من PBS المعقم. كرر التشريح مع أكبر عدد ممكن من الفئران حسب الحاجة.
   ملاحظه: يمكن دمج الطحال من عدة فئران في طبق واحد. قم بإجراء الخطوات التالية باستخدام الكواشف والمعدات المعقمة في غطاء معقم.
4. اهرسي الطحال (الطحال) بالسطح المسطح لمكبس حقنة معقمة.
5. ضع مصفاة 40 ميكرومتر أو 70 ميكرومتر في أنبوب مخروطي سعة 50 مل واغسل المصفاة ب 5 مل من PBS لتجهيزها. انقل معلق الطحال (الطحال) إلى المصفاة واستمر في الهرس برفق من خلال المصفاة. اغسل الطبق ب 10 مل من PBS وانقل الغسيل إلى المصفاة. استمر في الهرس حتى يختفي اللون الأحمر من المصفاة.
6. تخلص من المصفاة وقم بتدوير الأنبوب على 500 × جم لمدة 5 دقائق عند RT. قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة شفاقت.
7. أعد تعليق حبيبات الخلية في 5 مل (لما يصل إلى ثلاثة طحال) من محلول تحلل ACK المسخن مسبقا إلى RT وتحلل خلايا الدم الحمراء لمدة 4 دقائق.
8. أوقف التفاعل باستخدام 5 مل من وسائط خلية NIT-1 (الموضحة أعلاه) لكل 5 مل من المخزن المؤقت للتحلل. مرر معلق الخلية من خلال مصفاة جديدة لإزالة التكتلات. تخلص من المصفاة ، وقم بتدويرها عند 500 × جم لمدة 5 دقائق في RT.
9. أعد تعليق حبيبات الخلية في 20 مل من PBS ، واحسب الخلايا. تدور عند 500 × جم لمدة 5 دقائق في RT. أعد تعليق الخلايا في PBS معقم بتركيز 1 × 10⁸ خلايا / مل (حجم الحقن 0.1 مل / فأر) في أنبوب تفاعل آمن سعة 1.5 مل.
10. قم بتخزين الخلايا على الجليد (لمدة لا تزيد عن 1 ساعة) أو احتفظ بالخلايا في RT ، وانتقل إلى حقن وريد الذيل على الفور.

< p class = "jove_title" >5. الحقن الوريدي لخلايا الطحال السكري عبر وريد الذيل الجانبي

1. قم بتسخين جسم الفئران المتلقية البالغة NOD-scid (على سبيل المثال ، باستخدام مصباح حراري لمدة ~ 5-10 دقائق) لتوسيع الأوردة (وهذا يساعد على التصور والحقن في الوريد).
   ملاحظه: لتجنب ارتفاع درجة حرارة الفئران ، لا تتجاوز هذا الوقت. راقب دائما الحالة الصحية. إذا بدت الفئران منهكة أو غير متحركة ، فقم بإيقاف تشغيل المصباح الحراري على الفور.
2. قم بتسخين تعليق الخلية. قم بإعداد حقنة معقمة (0.3-1.0 مل) بإبرة معقمة (27-30 جم ، 0.3 مم / 0.5 بوصة أو أصغر) ، أو استخدم حقنة أنسولين معقمة سعة 0.5 مل بإبرة 0.3 مم (0.5 بوصة). احتفظ دائما بالإبرة معقمة واستخدم صينية معقمة إذا كان يجب وضع المحقنة بين الحقن.
3. أعد تعليق محلول خلايا الطحال قبل كل حقنة. لكل فأر، ارسم 100 ميكرولتر من معلق خلايا الطحال الدافئ والمختلط في المحقنة. تأكد من عدم وجود فقاعات هواء في المحقنة أو في التعليق.
   ملاحظه: تأكد من تجهيز جميع المعدات والمستلزمات (مناديل كحولية للتطهير ، وحقنة محملة بخلايا الطحال المراد حقنها ، وقفص جديد لفصل الفئران المحقونة) قبل وضع الماوس في جهاز التقييد.
4. ضع الماوس في جهاز التقييد. التقط الذيل باليد غير المهيمنة وحدد موقع أحد عروق الذيل الجانبية. قم بتدوير الذيل برفق إذا لزم الأمر. امسح الذيل بمنديل مطهر (70٪ كحول الأيزوبروبيل) لتنظيف البشرة وزيادة رؤية الوريد.
5. أدخل الإبرة بزاوية حادة في المنطقة الوسطى من الذيل باليد المهيمنة. مع توجيه شطبة الإبرة لأعلى ، حرك الإبرة بضعة ملليمترات عبر الجلد. < / > ملاحظه: تأكد من أن الإبرة موازية للوريد وتوضع تحت الجلد قليلا. كن مستعدا للحركات المفاجئة للماوس / الذيل مباشرة بعد اختراق جدار الجلد / الوعاء الدموي. يجب أن يبدو الإدخال الناجح للإبرة وكأنه "انزلاق ناعم" في الوريد. إذا كانت هناك حاجة إلى محاولة أخرى ، فتحرك لأعلى الذيل باتجاه الجسم.
6. ضع ضغطا برفق على المحقنة لحقن تعليق خلايا الطحال. لا تسمح للإبرة بالتحرك أكثر للداخل أو الخارج عند الحقن. تكون الحقن الناجحة سلسة دون الشعور بأي ضغط خلفي أثناء الحقن ويشار إليها بتدفق دم شفاف / أبيض بعد الحقن مباشرة.
7. حرر الإبرة برفق من الوريد واضغط بضغط خفيف على الذيل بمنديل تطهير حتى يتوقف النزيف. حرر الماوس من جهاز التقييد ، وانقله برفق إلى قفص معد حديثا.
   ملاحظه: حقن اثنين إلى ثلاثة فئران تحكم لا تتلقى عملية زرع خلايا NIT-1 مع خلايا الطحال لتأكيد قدرة خلايا الطحال ذاتية التفاعل على إحداث مرض السكري ، والذي يستغرق حوالي 2-4 أسابيع بعد الحقن.

فئة < p = "jove_title" >6. التصوير الحيوي في الجسم الحي لطعوم NIT-1

ملاحظة: قم بتصوير الطعوم مرة إلى مرتين في الأسبوع. في يوم الزرع ، انتظر ساعتين على الأقل بعد عملية الزرع للسماح للطعوم بالاستقرار وضمان تعبير لوسيفيراز مستقر. إذا كان الوقت عاملا محددا ، فقد يتم إجراء القياس الأولي في اليوم 1 بدلا من ذلك. جدول التصوير الأولي الموصى به هو اليوم 0 أو اليوم 1 بعد الحقن ، واليوم 5 ، واليوم 10 ، واليوم 14 ، واليوم 18 ، واليوم 25. ومع ذلك ، قم بتعديل الجدول الزمني بناء على تقدم المناعة الذاتية كما هو محكوم عليه بفقدان إشارة الإضاءة الحيوية.

1. قم بإعداد محلول 15 مجم / مل D-luciferin في برنامج Dulbecco's PBS. حرك عند RT ليذوب ، ومرشح معقم (0.22 ميكرومتر). قم بتخزين 1 مل من الحصص عند -20 درجة مئوية ، ثم قم بإذابة الثلج حسب الحاجة.
   ملاحظه: يمكن إعادة تجميد الاقتباسات.
2. قبل 5 دقائق على الأقل من التصوير ، قم بحقن الفئران داخل الصفاق باستخدام حقنة 1 مل وإبرة 26 جم بمحلول D-luciferin بجرعة 150 مجم / كجم. < / > ملاحظه: استخدم حقنة وإبرة جديدة لكل فأر.
3. تخدير الفئران عن طريق استنشاق الأيزوفلوران وفقا للإرشادات المؤسسية. الشروط الموصى بها هي 2.5٪ إيزوفلوران بمعدل تدفق 1.5 لتر / دقيقة إلى غرفة الضربة القاضية ومعدل إخلاء 9 لتر / دقيقة.
4. قم بتليين عيون بمرهم للعيون لمنع الجفاف.
5. افتح البرنامج المرتبط بجهاز التصوير. إنشاء مستخدم جديد و / أو تسجيل دخول. في لوحة التحكم في أسفل اليمين ، حدد تهيئة (الشكل 1 أ). لحفظ بيانات التصوير تلقائيا، قم بإنشاء المجلدات المناسبة على الكمبيوتر، ثم حدد اكتساب | الحفظ التلقائي في ... (الشكل 1 أ). بمجرد انتهاء تهيئة الأداة ، اضبط وقت التعريض الضوئي على 1 دقيقة.
   ملاحظه: يتم عرض معلمات التصوير الكاملة في الشكل 1 ب.
6. انقل الفئران واحدة تلو الأخرى من غرفة الضربة القاضية إلى أداة التصوير. ضع الفأر على بطنه مع أطرافه مفلطحة ، ووجه رأسه برفق إلى مخروط الأنف. معدل تدفق الأيزوفلوران البالغ 0.25 لتر / دقيقة الذي يتم تسليمه عبر مخروط الأنف مناسب للحفاظ على التخدير أثناء التصوير. قم بتسطيح الماوس برفق عن طريق الضغط على منتصف ظهره بكلتا يديه ثم بسط اليدين للخارج ومتباعدتين.
7. حدد الحصول (الشكل 1 ب). سجل أي تفاصيل ذات صلة بالتجربة في النافذة المنبثقة (الشكل 1C).
   ملاحظه: انظر الشكل 2 أ للحصول على صور تمثيلية لثلاث فئران من الإناث NOD-scid البالغة من العمر 8 أسابيع تم زرعها بطعمين في نقاط زمنية مختلفة.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: لقطات شاشة لأوامر البرنامج لتصوير الطعوم المضيئة بيولوجيا. (أ) قبل التصوير، حدد تهيئة لإعداد الأداة. يمكن حفظ الصور تلقائيا في مجلد من اختياره عن طريق تحديد اكتساب | الحفظ التلقائي على... (B) نظرة عامة على معلمات التصوير. بمجرد وضع الماوس في الجهاز، حدد اكتساب. (ج...

المواد