تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
< p class = "jove_title" >
1. المواد والكواشف
- استخدم إناث بعوض Anopheles stephensi (سلالة Sda500) التي تتغذى على الفئران المصابة بعد 3-5 أيام من ظهورها وظهرها كما هو موضح سابقا.
- استخدم الطفيليات المتصورة بيرغي ANKA استنساخ يعبر عن جين البروتين الفلوري الأخضر (GFP) تحت سيطرة مروج صدمة الحرارة التأسيسي 70 (HSP70). ينتج عن هذا تألق ساطع طوال دورة حياة الطفيلي.
- استخدم إناث الفئران C57BL / 6JRj (7 أسابيع).
ملاحظه: يتم سرد جميع الكواشف المستخدمة في البروتوكول الموصوف في Table of Materials / Equipment.
فئة
2. عزل Sporozoite الموهن بالإشعاع من الغدد اللعابية للبعوض
- بين 18-25 يوما بعد وجبة الدم المعدية ، اجمع البعوض وتخديره بالتبريد في أنبوب سعة 15 مل على الجليد كما هو موضح سابقا. انقلها بعناية إلى طبق بتري عن طريق قلب الأنبوب. حافظ على الحشرات على الجليد وعرض البعوض لجرعة 12 كرادا من الإشعاع γ أو X.
- عزل البوغات الموهنة من الغدد اللعابية للبعوض المشعع كما هو موضح سابقا. اجمع الغدد اللعابية المصابة بحجم صغير (حوالي 15 ميكرولتر) من 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (DPBS) من Dulbecco على الجليد وسحقها برفق لإطلاق البوغية.
ملاحظه: يعد حقن معلق طفيلي عالي التركيز في حجم صغير أمرا بالغ الأهمية ، لذلك من الضروري حصاد عدد كاف من الغدد اللعابية من عدد كبير من البعوض المصاب جيدا المختار مسبقا ، كما يتضح من تعبيرهم القوي عن التألق الأخضر.
- قم بتصفية معلق البوغية من خلال غطاء مصفاة خلية 35 ميكرومتر يتكيف مع أنبوب طرد مركزي دقيق منخفض الالتصاق 1.5 مل من أجل القضاء على التكتلات وحطام البعوض.
- احسب العدد الإجمالي للسبوغيات المعزولة كما هو موضح سابقا واضبط تركيز معلق الطفيليات مع 1x DPBS بارد للحصول على 83,000 sporozoites / μl. قم بتخزين الطفيليات على الجليد مع متابعة الخطوات التالية.
- اجمع العدد المكافئ من الغدد اللعابية من البعوض غير المصاب والتي سيتم استخدامها كتحكم سلبي ومعالجة العينة كما هو موضح في الخطوتين 2.2 و 2.3. قم بتخفيف العينة كما هو موضح أعلاه للحصول على تركيز مماثل من مستخلصات الغدد اللعابية في المعلق.
ملاحظه: يمكن تخزين Sporozoites على الجليد لمدة أقصاها 2 ساعة. ومع ذلك ، من الناحية المثالية يتم حقنها في غضون ساعة بعد سحق الغدد اللعابية.
< p class = "jove_title" >
3. حقن Sporozoites في الطبقة الجلدية للأذن
- تخدير عن طريق الحقن داخل الصفاق لخليط الكيتامين (50 مجم / كغ) / زيلازين (5 مجم / كغ). انتظر من 5 إلى 8 دقائق حتى يكون الفأر في حالة فقدان للوعي وقم بتطبيق مرهم العين على العينين لمنع جفاف القرنية. قم بتقييم عمق التخدير عن طريق إجراء قرصة لطيفة على إصبع القدم على كلتا القدمين الخلفيتين.
ملاحظه: تستمر جرعة التخدير لمدة تقل عن 20 دقيقة ، لذلك يجب القيام بالخطوات التالية بسرعة.
- قم بتثبيت صيوان الأذن للفأر عن طريق تثبيت الجانب البطني بشريط شفاف تم وضعه مسبقا تحت مجهر مجسم (الشكل 1 أ). اضغط برفق على الأذن لتجنب تلف الأوعية الدموية.
- قم بتحميل حقنة 10 ميكرولتر / إبرة مشطوفة قياس 35 مع 0.6 ميكرولتر من الطفيليات المعلقة.
- قم بتوصيل تعليق البوغية في 4 مواقع حقن (0.15 ميكرولتر لكل موقع) عن طريق إدخال الإبرة بعناية على الجانب الظهري من الأذن (الشكل 1 أ) ، أسفل البشرة ، مع شطبة لأعلى ، مع الحرص على تجنب أي أوعية دموية. اترك الإبرة في الأدمة لبضع ثوان لمنع ارتجاع الحاقن قبل إزالته. لاحظ حطاطة مميزة في كل موقع حقن في نهاية الإجراء (الشكل 1 ب و 1 ج).
- بعد الحقن ، قم بإزالة الأذن بعناية من الشريط.
- حقن الأذن المقابلة بنفس جرعة الطفيليات باتباع الخطوات 3.2-3.4.
- حقن 2 من الفئران الإضافية إما ب 0.6 ميكرولتر من 1x DPBS أو 0.6 ميكرولتر من 1x DPBS + مستخلص الغدد اللعابية من البعوض غير المصاب من أجل تقييم الاستجابة الالتهابية بوساطة الحقن وحده وترسب مادة البعوض في الأدمة.
- راقب تعافي الفأر من التخدير قبل إعادته إلى القفص.
ملاحظه: يمكن مراقبة ترسب البوغات المناسب في الجلد عن طريق المجهر الفلوري (الشكل 2 أ و 2 ب) ، حيث يتم تحضير الفأر كما هو موضح سابقا.
