توليد خلايا CD8 T موجبة مفردة من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات

الملخص

المصدر: Good، M. L. ، et al. باستخدام الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة البشرية لتوليد الخلايا التائية الخاصة بمستضد الورم. J. Vis. Exp. (2019).

يوضح هذا الفيديو فحصا لتوليد خلايا CD8αβ + T المستحثة من مستضد الورم (iPSC). تنمو iPSCs الخاصة بمستضد الورم على طبقة أحادية للخلايا اللحمية وتمايزها إلى خلايا سلف مكونة للدم (HPCs). يتم تمييز الحوسبة عالية الأداء إلى خلايا تائية مزدوجة الموجب CD4 + CD8 + باستخدام وسيط تمايز. ثم يتم تحفيز هذه الخلايا لتوليد خلايا تائية موجبة مفردة تعبر عن CD8.

البروتوكول

فئة < ص = "jove_title" >1. زراعة الخلايا الجذعية الجذعية الجذعية البشرية (hiPSCs) على الخلايا الليفية الجنينية للفأر (MEF)

ملاحظة: يمكن أيضا استخدام طرق بديلة لزراعة hiPSCs ، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر البذر على صفيحة من 6 آبار مطلية مسبقا بالجيلاتين ، أو خليط البروتين الجيلاتيني ، أو اللامينين المؤتلف 511 ، أو أي مصفوفة أخرى خارج الخلية تستخدم في توسيع hiPSC ، ويتم زراعتها باستخدام وسائط محددة مصممة خصيصا لزراعة الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات.

1. زراعة MEF
   1. قم بتغطية طبق بتري لزراعة الخلايا مقاس 10 سم ب 4 مل من الجيلاتين 0.1٪ واحتضانه لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
   2. قم بإذابة قارورة من 4 × 10⁶ MEF مشعة بسرعة في 10 مل من وسائط MEF 37 درجة مئوية (Dulbecco's Modified Eagle Medium [DMEM] + 10٪ مصل بقري الجنين (FBS) + 1x بنسلين ستربتومايسين + 1x مكمل L-glutamine). جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بشفط المادة الطافية وإعادة تعليق حبيبات الخلية في 9 مل من وسائط MEF.
   3. أخرج الطبق المغطى بالجيلاتين من الحاضنة. شفط الجيلاتين وأضف 7 مل من وسائط MEF. لوحة 3 مل من تعليق MEF (من الخطوة 1.1.2) على الطبق المطلي بالجيلاتين. هز الطبق جنبا إلى جنب ومن الأمام إلى الخلف لضمان التوزيع المتساوي ل MEF على الطبق. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 8-36 ساعة.
2. تمرير hiPSC على MEF
   ملاحظة: تم إنشاء البيانات باستخدام مستضد الورم الميلانيني المعترف به بواسطة الخلايا التائية 1 (MART-1) iPSC المشتق من الخلايا الليمفاوية المتسللة للورم الميلانيني المزروع على المدى الطويل (TIL) ، والتي تتعرف على وجه التحديد على ببتيد MART-1 في سياق مستضد الكريات البيض البشرية (HLA) -A * 02:01.
   1. مرور hiPSCs عندما يتراوح قطر المستعمرات بين 0.8 - 1.2 مم. قبل المرور ، تحقق من مستعمرات hiPSC في مجهر مجسم وقم بإزالة أي مناطق تمايز عن الثقافة باستخدام الحافة البلاستيكية لطرف 200 ميكرولتر.
   2. استنشق الوسائط المستهلكة وإضافة 10 مل من وسائط hiPSC (وسائط زراعة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية [ES] [جدول المواد] + 10 نانوغرام / مل عامل نمو الخلايا الليفية البشرية الأساسية [hbFGF]) مكملة بمثبط بروتين كيناز (ROCK) المرتبط ب 10 ميكرومتر.
   3. أمسك طبق زراعة الخلية بيد واحدة وقم بلف أداة مرور الخلية التي تستخدم لمرة واحدة عبر الطبق بأكمله في اتجاه واحد. قم بالضغط الكافي بحيث تلامس شفرة الأسطوانة بأكملها طبق الثقافة وتحافظ على ضغط موحد أثناء حركة التدحرج.
   4. قم بتدوير طبق الثقافة عند 90 درجة وكرر الخطوة 1.2.3. اعرض اللوحة في المجهر لتأكيد القطع المناسب للمستعمرات بصريا ، والتي يجب أن تبدو متقلبة. افصل المستعمرات المقطوعة عن طريق التنظيف الميكانيكي اللطيف باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر.
      ملاحظه: يجب أن يتم فصل المستعمرات المقطوعة عن طريق التنظيف الميكانيكي مباشرة بعد قطع المستعمرات باستخدام الأسطوانة لأنه بعد 3 دقائق ، ستبدأ المستعمرات المقطوعة في إعادة التصاق بالطبق ، وسيصبح من الصعب فصل المستعمرات ذات الحجم المتجانس عن طريق التنظيف.
   5. انقل 350 - 600 كتلة من المستعمرات المقطوعة إلى طبق جديد مقاس 10 سم من MEF (مطلي من 8 إلى 36 ساعة قبل مرور hiPSC) مع 10 مل من وسائط hiPSC الطازجة المكملة بمثبط 10 ميكرومتر من ROCK. احتضان عند 37 درجة مئوية
      ملاحظة: 600 تمثل الكتل تقريبا 1.0 × 10⁶ MART-1 iPSC وستنتج 0.5-1.0 × 10⁶ خلايا DP في اليوم 35. ومع ذلك ، ستختلف الأرقام المتوقعة اعتمادا على فاعلية خط الخلية الأولية وظروف الاستزراع.
   6. في اليوم التالي ، قم باستنشاق الوسائط المستهلكة وأضف 10 مل من وسائط hiPSC الجديدة. قم بتغيير وسائط hiPSC كل 1-2 أيام ، اعتمادا على معدل نمو hiPSC.

< p class = "jove_title" >2. تحضير خلايا OP9 / DLL1 للزراعة المشتركة مع hiPSCs

1. زراعة خلايا OP9/DLL1 في وسائط OP9 [α كحد أدنى من الوسط الأساسي (α-MEM) + 20٪ مصل بقري جنيني (FBS) + 1x بنسلين ستربتومايسين] عند 37 درجة مئوية. عندما تصل خلايا OP9 / DLL1 إلى التقاء ، قم بشفط الوسائط واغسلها مرة واحدة ب 5 مل من محلول ملحي خال من المغنيسيوم والكالسيوم والفينول الخالي من الفوسفات (PBS).
2. شفط PBS وأضف 2 مل من 0.05٪ حمض التربسين - إيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA). احتضن لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، أضف 4 مل من وسائط OP9 وقم بفصل طبقة الخلية ميكانيكيا عن طريق سحب العينات لعمل تعليق أحادي الخلية.
3. انقل معلق الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر لتجنب تكتل الخلايا. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بشفط المادة الطافية وإعادة تعليقها في 12 مل من وسائط OP9.
4. أضف 8 مل من وسائط OP9 إلى ستة أطباق بتري جديدة لزراعة الخلايا مقاس 10 سم. لوحة 2 مل من معلق خلية OP9 / DLL1 من الخطوة 2.3 إلى كل طبق جديد مقاس 10 سم. هز الطبق جنبا إلى جنب ثم من الأمام إلى الخلف لضمان التوزيع المتساوي ل OP9 / DLL1 على الطبق.
5. احتضان عند 37 درجة مئوية. كرر المرور كل 2-3 أيام عندما تصل الخلايا إلى التقاء.
   ملاحظه: من المهم عمل مخزون مجمد كاف من خلايا OP9 / DLL1 وإذابة مخزون جديد كل 4-6 أسابيع.

فئة

3. التمايز في المختبر لمركبات hiPSCs إلى خلايا CD8αβ + موجبة مفردة (SP)

1. قم بإعداد أطباق OP9 / DLL1 الجيلاتينية قبل أسبوع واحد من الزراعة المشتركة مع hiPSCs. لتحضير محلول جيلاتين 0.1٪ ، أضف 5 مل من محلول الجيلاتين بدرجة حرارة الغرفة (RT) إلى 500 مل من PBS.
   1. قم بتغطية 3 أطباق بتري جديدة مقاس 10 سم بإضافة 4 مل لكل طبق من الجيلاتين 0.1٪. احتضان 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
   2. شفط الجيلاتين وأضف 8 مل من وسائط OP9 إلى كل طبق. مرر طبقا واحدا ملتقى من OP9 / DLL1 (كما هو موضح في القسم 2 أعلاه) إلى ثلاثة أطباق مغلفة مسبقا بالجيلاتين.
2. بعد 4 أيام ، أضف 10 مل من وسائط OP9 إلى كل طبق 10 سم من OP9 / DLL1 على الجيلاتين لمدة 20 مل من الوسائط لكل طبق.
3. بعد 7-8 أيام ، ابدأ الاستزراع المشترك HIPSC على أطباق OP9 / DLL1 المتجانسة (يوم التمايز 0).
   1. استنشق الوسائط المستهلكة من طبق متقارب 10 سم من hiPSCs على MEF. أضف 10 مل من وسائط OP9. قم بقص وفصل مستعمرات hiPSC باستخدام أداة مرور الخلايا التي تستخدم لمرة واحدة ، كما هو الحال في الخطوتين 1.2.3 و 1.2.4.
   2. انقل 350 - 600 كتلة من المستعمرات المقطوعة إلى طبق OP9/DLL1 مغطى مسبقا بحجم 10 سم (الخطوة 3.1) مع 10 مل من وسائط OP9 الطازجة باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر. هز طبق الثقافة جنبا إلى جنب ثم من الأمام إلى الخلف لضمان التوزيع المتساوي للمستعمرات.
      ملاحظه: بدلا من ذلك ، يمكن استخدام الأجسام الجنينية عالية PSC المكونة مسبقا (EBs) أو تعليق متكتل صغير. ومع ذلك ، يفضل استخدام أداة مرور الخلايا التي تستخدم لمرة واحدة أو نظام تكوين EB لإنتاج كتل hiPSC ذات حجم موحد.
4. في اليوم 1 ، قم بشفط الوسائط المستهلكة واستبدلها ب 20 مل من وسائط OP9 الجديدة. ستظهر كتل hiPSC المستزرعة بشكل مشترك على OP9 / DLL1 لمدة يوم واحد كمستعمرات صغيرة مستديرة أحادية الطبقة (الشكل 1).
5. في اليوم 5 ، استنشق 10 مل من الوسائط المستهلكة وأضف 10 مل من وسائط OP9 الطازجة. ستبدأ مستعمرات hiPSC في التمايز إلى الأديم المتوسط البدائي ، الذي يتميز بمركز مظلم متعدد الطبقات.
6. في اليوم 9 ، استنشق 10 مل من الوسائط المستهلكة وأضف 10 مل من وسائط OP9 الجديدة. في هذه المرحلة ، ستتطور الهياكل المركزية متعددة الطبقات إلى أشكال تشبه القبة ، وستصبح منطقة شبيهة بالشبكة الطرفية واضحة.
7. في اليوم 13 ، حصاد الخلايا السلفية المكونة للدم (HPCs) (الشكل 1). تتميز الهياكل المشتقة من hiPSC في اليوم 13 بعضوية مركزية مظلمة محاطة بشبكة من المناطق الشبيهة بالقبة ، ممثلة لمناطق المكونة للدم (HZs) التي تم الإبلاغ عنها سابقا لإحاطة أسلاف المكونة للدم المشتقة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية.
   ملاحظة: يشير وجود الهياكل الشبيهة بالقبة إلى عملية ناجحة حتى في حالة عدم وجود مراكز مظلمة. قد يكون عدم القدرة على إنتاج الحوسبة عالية الأداء بسبب رداءة نوعية OP9/DLL1, جودة الكثير من FBS, التقاء كتل iPSC البذور على OP9/DLL1 (350-600 كتل هو الأمثل), و/أو الاختلافات في فاعلية خطوط iPSC لإنتاج سلائف المكونة للدم.
   1. قم بشفط الوسائط المستهلكة واغسلها 1x ب 5 مل من محلول الملح المتوازن الخالي من الفينول 1x المعدل بالكالسيوم والمغنيسيوم (HBSS).
   2. قم بشفط HBSS وأضف 250 ميكرولتر من 5000 وحدة / مل كولاجيناز IV في 10 مل من HBSS. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة. قم بشفط HBSS باستخدام الكولاجيناز IV واغسله مرة واحدة باستخدام 5 مل من PBS.
   3. قم بشفط PBS وأضف 5 مل من 0.25٪ Trypsin-EDTA. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك ، أضف 4 مل من وسائط OP9 وقم بفصل طبقة الخلية عن طريق سحب العينات لعمل تعليق أحادي الخلية.
   4. انقل معلق الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بشفط المادة الطافية وإعادة تعليقها في 10 مل من وسائط OP9.
   5. تعليق خلية الصفيحة على طبق بتري جديد لزراعة الخلايا مقاس 10 سم (انظر الخطوتين 3.1.1 و 3.1.2). احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة. بعد ذلك، اجمع الخلايا غير الملتصقة عن طريق سحب العينة اللطيف.
   6. انقل معلق الخلية المجمعة إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. شفط المادة الطافية وأعد تعليقها في 10 مل من وسائط التمايز [وسائط OP9 مع 5 نانوغرام / مل عامل الخلايا الجذعية البشرية (hSCF) ، 5 نانوغرام / مل Flt3 ligand البشري (hFLT3L) ، و 5 نانوغرام / مل إنترلوكين بشري 7 (hIL-7)].
   7. ضع معلق الخلية على طبق متقارب جديد مقاس 10 سم OP9 / DLL1.
8. في اليوم 16 ، قم بالمرور على الخلايا.
   1. افصل الخلايا غير الملتصقة ميكانيكيا عن طريق سحب العينة اللطيف والتصفية من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بشفط المادة الطافية وإعادة تعليقها في وسائط تمايز 10 مل.
   2. ضع معلق الخلية على طبق متقارب جديد مقاس 10 سم OP9 / DLL1.
9. استمر في مرور الخلايا غير الملتصقة كل 5-7 أيام بعد ذلك بتكرار الخطوة 3.8.
10. في اليوم 35 ، قم بإثراء CD4 + CD8 + مزدوج الإيجابي (DP) وتحفيز إنتاج خلايا CD8αβ + موجبة مفردة (SP) خلايا تائية (الشكل 2).
    1. افصل الخلايا غير الملتصقة ميكانيكيا عن طريق سحب العينات والتصفية برفق من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر لإزالة التكتلات. قم بإثراء خلايا CD4 + عن طريق عزل الخرزة المغناطيسية CD4 وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
       ملاحظه: الأساس المنطقي لاستخدام الخرز المغناطيسي CD4 هو إزالة الخلايا السالبة المزدوجة (DN) CD4-CD8 من الثقافة ، حيث ثبت أنها تسبب القتل المباشر لخلايا CD4 + CD8 + DP بعد التحفيز.
    2. عد الخلايا المخصبة CD4 الحية باستخدام مقياس كثافة الدم Neubauer وصبغة Trypan الزرقاء. يعلق في وسائط OP9 بتركيز إجمالي 0.5 × 10⁶ خلايا / مل. Aliquot 1 مل من تعليق الخلية (0.5 × 10⁶ خلايا) في كل بئر من ثقافة الأنسجة قاع مسطح 24 صفيحة صحية من OP9 / DLL1 المتقارق.
    3. أضف 100 وحدة دولية من الإنترلوكين البشري 2 (hIL-2) ، و 5 نانوغرام / مل hIL-7 ، و 500 نانوغرام / مل الجسم المضاد CD3 المضاد للإنسان ، و 2 ميكروغرام / مل المضاد ل CD28 المضاد للإنسان ، ثم استزراعه عند 37 درجة مئوية.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: توليد الخلايا السلفية المكونة للدم المشتقة من hiPSC. (أ) نظرة عامة تخطيطية على تمايز hiPSCs إلى سلالة المكونة للدم باستخدام الزراعة المشتركة OP9 / DLL1. (ب) ظهور الهياكل المشتقة من hiPSC في الأيام 1 (أعلى اليسار) و 3 (أعلى اليمين) و 7 (أسفل اليسار) و 13 (أسفل اليمين). أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر. (ج) تحليل التدفق الخلوي للخلايا ا...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات طبق 10 سم شركة كورنينج 353003 مضاد ل CD3 ، إنسان BD Biosciences القط # 561812 ، RRID: AB_1089628 مضاد ل CD34 ، إنساني BD Biosciences القط # 348791 ، RRID: AB_400381 مضاد CD4 ، إنساني بيوليجند القط # 344612 ، RRID: AB_2028479 مضاد ل CD43 ، إنساني BD Biosciences القط # 560198 ، RRID: AB_1645460 مضاد CD7 ، إنساني BD Biosciences القط # 555361 ، RRID: AB_395764 مضاد ل CD8a ، إنساني BD Biosciences القط # 555369 ، RRID: AB_398595 مضاد ل CD8b ، إنساني BD Biosciences القط # 641057 ، RRID: AB_1645747 مكافحة TCRb ، إنسان BD Biosciences القط # 555548 ، RRID: AB_395932 CD28 الجسم المضاد أحادي النسيلة البشري (15E8) ، درجة وظيفية نقية ميلتينيل بيوتيك 130-093-375 CD3 الجسم المضاد أحادي النسيلة البشري (OKT3) ، درجة وظيفية نقية ميلتينيل بيوتيك 130-093-387 Microbeads CD4 ، الإنسان ميلتينيل بيوتيك 130-045-101 مصفاة الخلية 100 ميكرومتر فيشر ساينتيك 22-363-549 مصل الأبقار الجنينية (FBS) الجوزاء 100-500 Flt-3 ligand أنظمة البحث والتطوير 427-فلوريدا محلول الجيلاتين 2٪ سيجما ألدريتش G1393-100 مل جلوتا ماكس (100X) ثيرمو فيشر العلمي 35050-061 مكمل L-Glutamine HBSS مجم + Ca + خال من الفينول والأحمر جيبكو 14025-092 إنترلوكين -2 أنظمة البحث والتطوير 202-IL إنترلوكين -7 أنظمة البحث والتطوير 407 مل iTAG MHC Tetramer HLA-A * 0201 Mart1 Tetramer -ELAGIGILTV MBL قطة # TB-0009-2 مارت 1 - hiPSC فيزكاردو وآخرون ، الخلايا الجذعية للخلايا 2013 رايكن آي إم إس ميلان أ ، مارت 1 (26-35) InnoPep 3146-0100 محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM جيبكو 11140050 مسحوق αMEM جيبكو 61100061 الخلايا الليفية الجنينية للفأر (MEF) ثيرمو فيشر العلمي C57BL / 6 MEF معالج ب MITC 4M لكل منهما ؛ أ34962 OP9 / N-DLL1 مركز الموارد الحيوية Riken القط # RCB2927 ؛ RRID:CVCL_B220 OP9 / DLL1 البنسلين / الستربتومايسين ثيرمو فيشر العلمي 15140-122 الرقم الهيدروجيني الملحي المخزن بالفوسفات 7.4 (1x) ثيرمو فيشر العلمي 10010-023 الرئيسيات ES خلية المتوسطة ريبروسيل RCHEMD001 وسائل الإعلام الثقافية البشرية مثبط Rhok (Y-27632 ثنائي هيدروكلوريد) توكرس 1254 RPMI 1640 جيبكو 11875093 عامل الخلايا الجذعية (SCF) أنظمة البحث والتطوير 455-MC ستيم برو EZPassage هاتف: 23181-010 ورم T2 ATCC T2 (174 × CEM. T2) (ATCC® CRL-1992™) التربسين EDTA (0.05٪) ، أحمر الفينول ثيرمو فيشر العلمي هاتف: 25300-062 التربسين EDTA (0.25٪) ، أحمر الفينول ثيرمو فيشر العلمي هاتف: 25200-072 U القاع 96 لوحة البئر شركة كورنينج 3799