تلطيخ مناعي الأنسجة لتصوير قياس الكتلة الخلوية

الملخص

< p class = "jove_content" >

يصف الفيديو تحضير عينة من الأنسجة لتصوير قياس الكتلة الخلوية. تتم معالجة الأنسجة أولا لكشف حواتم المستضد ، واختراق الخلايا ، وسد مواقع ربط الأجسام المضادة غير المحددة. بعد ذلك ، يتم تحضين الأنسجة بكوكتيل الأجسام المضادة المترافقة مع المعدن وبقعة نووية. أخيرا ، يتم تصوير عينة الأنسجة المعالجة باستخدام ماسح ضوئي.

البروتوكول

فئة < ص = "jove_title" >1. المعالجة المسبقة للأنسجة:

< p class = "jove_content" > للمناديل المجمدة الطازجة:

1. ضع برطمان زجاجي من كوبلين في الفريزر -20 درجة مئوية لمدة ساعة على الأقل قبل الاستخدام.
2. قم بإزالة الشرائح من الفريزر -80 درجة مئوية وضعها في وعاء كوبلن الزجاجي في الفريزر -20 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل.
3. تحت غطاء الدخان ، استخدم قاطع أمبولة لفتح أمبولة زجاجية 16٪ بارافورمالدهايد (PFA). تخلص من الزجاج المكسور بشكل مناسب.
4. أضف 10 مل من 16٪ PFA و 30 مل من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) إلى وعاء Coplin البلاستيكي. تأكد من أن PBS مبرد مسبقا إلى 4 درجات مئوية.
5. انقل هذا المحلول إلى الثلاجة 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل.
6. بعد 15 دقيقة ، انقل برطمان كوبلن الزجاجي مع الشرائح إلى الثلاجة 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
7. انقل الشرائح من البرطمان الزجاجي إلى وعاء Coplin البلاستيكي الذي يحتوي على محلول PFA البارد بنسبة 4٪.
8. ثبت الشرائح بنسبة 4٪ PFA لمدة 30 دقيقة داخل الثلاجة.
9. اشطف الشرائح ثلاث مرات في درجة حرارة الغرفة PBS لمدة 5 دقائق لكل منها ، مما يضمن شطفا شاملا بين الدورات.

فئة

لأنسجة FFPE:

1. ابدأ بأقسام الأنسجة المضمنة في البارافين (FFPE) المثبتة على شرائح المجهر القياسية الموجبة الشحنة بحجم 5 ميكرومتر.
2. قم بإزالة الشمع من الشرائح عن طريق تسخينها على حرارة 60 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
3. قم بإزالة الشرائح وقم بتبريدها إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق تقريبا.
4. ضع الشرائح في بريد منزلق واشطفها في حمام الزيلين لمدة 3 دقائق ، مرتين.
5. مرة أخرى ، اشطف الشرائح بالإيثانول بنسبة 100٪ لمدة دقيقة واحدة ، مرتين.
6. وبالمثل ، اشطف الشرائح بنسبة 95٪ و 70٪ من الإيثانول لمدة دقيقة واحدة لكل منهما.
7. أخيرا ، اشطف أخيرا مرتين في الماء المقطر لمدة 3 دقائق.
   ملاحظه: لا يمكن أن يستعصي Hyperion في نطاق 2 مم من حافة الانزلاق ، الأنسجة المركزية قدر الإمكان.

< p class = "jove_title" >2. استرجاع الحاتمة الناجم عن الحرارة (HIER)

1. تحضير حمض Tris-ethylenediaminetetraacetic (EDTA) pH9 العازلة:
   يتم
   1. شراء Abcam ab93684 Tris-EDTA pH9 HIER Buffer بمعدل 100x ويتم تخفيفه إلى 1x في ماء كروماتوغرافيا سائل عالي الأداء (HPLC).
   2. على سبيل المثال: 2.5 مل Abcam ab93684 في 247.5 مل من ماء HPLC.
      ملاحظه: لا ينبغي استخدام المخزن المؤقت الذي يزيد عمره عن ستة أشهر.
2. قم بإعداد غرفة إزالة الهوية لتسخين الشرائح. أولا ، املأ قاع الغرفة ب 500 مل من ماء الصنبور. ثم أضف 250 مل من ماء الصنبور إلى كل من الحاويات الجانبية و 200 مل من ماء الصنبور إلى الحاوية المركزية.
3. ضع ما يصل إلى 3 شرائح في مرسل بريدي مكون من 5 أماكن.
4. املأ مرسل الشرائح بالمخزن المؤقت HIER حتى يتم غمر الأنسجة بالكامل. ملاحظه: تأكد من أن جهاز البريد المنزلق به ثقب صغير في الأعلى لتنفيس البخار ومنع الضغط.
5. قم بتشغيل "البرنامج 4" لمدة 20 دقيقة عند 95 درجة مئوية.
6. وفي الوقت نفسه ، قم بتسخين غرف الحضانة مسبقا للخطوات اللاحقة (راجع الخطوة 3.5)
7. بعد الحضانة ، قم بإزالة البريد وضعه في حوض به ماء بارد من الصنبور.
8. اتركه ليبرد لمدة 5 دقائق.
9. قم بإزالة نصف المخزن المؤقت من البريد واستبدله بالماء المقطر. اتركه ليبرد لمدة 5 دقائق.
10. قم بإزالة المخزن المؤقت تدريجيا وقم بزيادة حجم الماء مرتين ، لكل منهما فترة تبريد مدتها 5 دقائق.
11. أخيرا ، اشطف الشرائح بالماء المقطر بنسبة 100٪.

3. حظر الربط غير المحدد

1. قم بإعداد المخزن المؤقت للحجب (محلول ملحي مخزن في Tris أو TBS ، 0.1٪ Triton X-100 ، 3٪ ألبومين مصل بقري أو BSA) عن طريق إضافة 150uL من TBS مع 10٪ BSA إلى 350uL من TBS مع 0.1٪ Triton X-10.
   ملاحظه: يتم تخزين TBS مع 10٪ BSA عند -20 درجة مئوية ويجب إذابته طازجا في كل مرة.
2. باستخدام بريد منزلق أو برطمانات كوبلين ، اغسل الشرائح لمدة 5 دقائق في TBS ، 0.1٪ Triton X-100 مرتين.
3. قم بإزالة الشريحة من المرسل واستخدم مسح Kim لإزالة أي مخزن مؤقت خارج دائرة PAP. اتركه ~ 1 دقيقة حتى يجف قليلا.
4. باستخدام P200 ، أضف بضع قطرات من المخزن المؤقت المانع على الأنسجة ، وهو ما يكفي لتغطيته. يجب أن يحافظ خط PAP على السائل فوق الأنسجة.
   ملاحظه: إذا لم يكن المخزن المؤقت محصورا في دائرة PAP ، فأعد رسم دائرة PAP حول الأنسجة لمنع فقدان الأجسام المضادة لاحقا.
5. احتضان الشريحة في درجة حرارة الغرفة في غرفة الرطوبة لمدة 1 ساعة. < / > ملاحظه: يعمل صندوق طرف الماصة الفارغ بشكل جيد لغرفة الرطوبة. تأكد من وجود كمية صغيرة من ماء الصنبور في القاع.

< p class = "jove_title" >4. تلطيخ بالأجسام المضادة المترافقة مع المعادن

1. قم بإزالة الأجسام المضادة المترافقة بالمعدن من 4 درجات مئوية وأجهزة الطرد المركزي عند 10,000 × جم لمدة دقيقة واحدة.
2. تحضير التخفيف الأمثل لمزيج الأجسام المضادة الرئيسي في TBS ، 0.1٪ Triton X-100 ، و 1٪ خليط BSA.
   ملاحظة: أ) يجب تحديد التخفيف الأمثل لكل جسم مضاد تجريبيا وهو أحد أهم الخطوات لتجارب قياس الكتلة الناجحة للتصوير. استخدم جدول بيانات Excel لحساب الأحجام. اصنع أكثر بقليل من المطلوب بسبب تكلفة الأجسام المضادة. على سبيل المثال ، إذا استغرق الأمر 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحظر ، فقم بعمل مزيج رئيسي 250uL. ب) يجب تحضير المزيج الرئيسي طازجا لكل تجربة أثناء خطوة الحظر.
3. بعد الحضانة (راجع الخطوة 3.5) ، قم بإزالة الشريحة من الحاضنة.
4. قم بإزالة المخزن المؤقت الزائد عن طريق النقر على الشريحة رأسيا وأفقيا على مناديل Kim. يجب أن يترك هذا بعض المخزن المؤقت المانع على الأنسجة ولكنه سيزيل معظمها.
5. اتركه ~ 1 دقيقة حتى يجف قليلا.
6. ضع الشريحة في غرفة الرطوبة عند 4 درجات مئوية واتركها تتوازن.
7. بعد ذلك ، قم بتقطيع مزيج الجسم المضاد الرئيسي بعناية على الأنسجة ، مع الحذر الشديد من احتواء المحلول داخل دائرة PAP.
8. أغلق غرفة الرطوبة واحتضن طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
9. بعد الحضانة طوال الليل ، قم بإزالة الشريحة من 4 درجات مئوية وإزالة المزيج الرئيسي الزائد عن طريق النقر على الشريحة رأسيا وأفقيا على مناديل Kim المبللة.
10. ضع الشريحة في البريد أو جرة كوبلين ؛ اغسلها لمدة 5 دقائق بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات أو PBS ، مكمل بنسبة 0.2٪ Triton X-100 ، مرتين.
11. ثم اغسل الشريحة في PBS لمدة 5 دقائق مرتين. قم بإزالة الشريحة واتركها تجف لمدة 1 دقيقة تقريبا.

< p class = "jove_title" >5. إقحام الحمض النووي

1. لإقحام الحمض النووي ، قم بتخفيف Intercalator-Ir 1: 1000 في PBS.
2. قم بوضع الماصة المخففة بعناية على الأنسجة ، مع الحرص الشديد على احتواء المحلول داخل دائرة PAP.
3. احتضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في غرفة الرطوبة المستخدمة في الحظر.
4. بعد ذلك ، اضغط على الشرائح عموديا وأفقيا على مناديل Kim المبللة لإزالة صبغة Intercalator-Ir الزائدة.
5. ضع الشريحة في البريد أو برطمان كوبلين واغسلها مرتين بماء HPLC لمدة 5 دقائق لكل منهما.
6. جفف الشرائح في مجفف لمدة 5 دقائق قبل المسح.

6. مسح الصور

1. لمسح الشرائح ، استخدم حفرا زجاجيا من طرف كربيد لخدش أربعة Xs باهتة في الشريحة. ستسمح نقاط التدريس الدقيقة بأفضل تسجيل للصور.
   ملاحظه: لا تقترب كثيرا من الحافة.
2. المسح الضوئي باستخدام ماسح ضوئي للمستندات المسطحة بما لا يقل عن 1200 نقطة في البوصة
3. قم بقص هذه الصورة قدر الإمكان من حدود الشريحة واحفظها على محرك أقراص محمول.
4. للتسجيل المشترك للصورة، امسح الشريحة ضوئيا على Hamamatsu NanoZoomer باستخدام "Pre_IMC" في اسم الملف.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: التمثيل التخطيطي لإجراء تلطيخ مناعي الأنسجة لتصوير قياس الكتلة

الخلوية

المواد