إنشاء تكوين خلية كاملة من خلال طريقة Patch Clamp

الملخص

المصدر: Segev ، A. et al. ، تسجيلات مشبك التصحيح للخلية الكاملة في شرائح الدماغ.J. Vis. Exp.(2016)

يوضح هذا الفيديو تقنية مشبك التصحيح للخلية الكاملة في شريحة دماغ الفأر. تنشئ هذه التقنية اتصالا مستقرا بين الماصة الدقيقة وغشاء الخلايا العصبية ، والتي تتعطل بشكل أكبر لإنشاء تكوين خلية كاملة لدراسة صحة الخلايا العصبية والاستجابات الفسيولوجية.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_content" >< strong style = "color: RGB (68 ، 0 ، 68) ؛ حجم الخط: 18 بكسل ؛ ">1. تحضير الشريحة

1. قم ببناء أو الحصول على غرفة استرداد الشريحة.
   ملاحظة: مبدأ غرفة الاسترداد واضح ومباشر ويمكن صنعه في المختبر (الشكل 1). باختصار ، الغرفة عبارة عن وعاء يتم فيه إدخال سلة لتثبيت شرائح الدماغ عند مستوى أقل من سطح السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي (aCSF).
2. على سبيل المثال ، احصل على أربع حلقات (ارتفاع 4 - 6 مم) (الشكل 1 أ ، منظر جانبي ؛ ب ، منظر علوي) عن طريق قطع حقنة 30 سم مكعب. بعد ذلك ، قم بلصق الشباك الممتدة (على سبيل المثال ، مقطوعة من خرطوم من النايلون) على جانب واحد من الحلقات لتثبيت شرائح الدماغ (الشكل 1 ب) ولصق الحلقات معا. < / > ملاحظة: يمكن استخدام مسدس الغراء.
   1. بمجرد لصق الحلقات الأربع ، قم بلصق جدار بلاستيكي منحني متساوي الساقين على شكل شبه منحرف على حلقتين (الشكل 1 أ و ب) لتحويل فقاعات الأكسجين من شرائح الدماغ المستعادة (الشكل 1 ج و د). كما هو موضح في الشكل 1D ، أدخل نظام نشر الأكسجين (هنا ، أنبوب تشتت الغاز) على نفس جانب الجدران البلاستيكية.
3. قبل التقطيع ، قم بالأكسجين (95٪ O₂/5٪ CO₂) وتبريد محلول التقطيع (انظر الخطوة 1.4) إلى 0 - 2 درجة مئوية.
4. املأ غرفة الاسترداد المخصصة ب aCSF القياسي في درجة حرارة الغرفة (RT). تأكد من أن aCSF مؤكسج جيدا (20-30 دقيقة ، قد يختلف الوقت وفقا لحجم الغرفة) قبل وضع الشرائح في غرفة الاسترداد. تأكد من أن فقاعات الغاز لا تتلامس بشكل مباشر مع الشرائح أو تعطلها.
5. قم بتبطين صينية الثلج الاهتزازية بالثلج واملأها بالماء البارد بحيث يتم غمر ثلث إلى نصف غرفة التقطيع. ضع بعناية نظام توصيل الأكسجين (على سبيل المثال ، حجر نشر الغاز) ومسبار درجة الحرارة في غرفة التقطيع بحيث لا يتداخل أي عنصر مع حركة الشفرة أو معالجة الشرائح.
6. تحضير منطقة التشريح والأدوات اللازمة لاستخراج الدماغ وتشريح منطقة الدماغ المطلوبة.
   ملاحظة: سيعتمد التشريح الدقيق الذي يتم إجراؤه على منطقة الدماغ المحددة التي تمت دراستها حيث تتطلب هياكل الدماغ المختلفة تقطيعا على مستويات مختلفة (على سبيل المثال ، الشرائح الإكليلية أو السهمية أو الأفقية).
   1. ضع الأدوات التالية على الوسادة السفلية: مقص قطع الرأس ، ومشرط ، ومقص صغير ذو طرف حاد مستقيم ، ملقط قنية الأوعية الدموية (أو أي أداة جراحية ذات طرف عريض ، مثل rongeurs ، وهي أكثر ملاءمة لجماجم الفئران) ، ملقط مرقئ منحني ، ملاقط ، ملعقة مغرفة ، ورق ترشيح ، طبق بتري ، شفرة حلاقة أحادية الحافة ، وغراء سيانواكريلات.
7. عندما تصل درجة الحرارة إلى 0-2 درجة مئوية ، انقل محلول التقطيع إلى غرفة التقطيع (الدرج العازلة).
8. تخدير الفأر في غرفة التجفيف باستخدام الأيزوفلوران. قد تختلف الكمية الدقيقة وفقا لحجم الغرفة المستخدمة ، ولكن بالنسبة لقفص صندوق الأحذية الصغير ، استخدم بضع قطرات (~ 3-4). اترك الماوس في القفص حتى يصبح غير متحرك (لا يستجيب للمنبهات اللمسية ؛ حوالي 15 ثانية للظروف الموضحة هنا). قم بإجراء اختبارات قرصة الذيل والقدم للتأكد من تخدير بعمق ، ثم قطع رأسه قبل أن يتوقف القلب عن النبض (يعزز صلاحية الخلية).
   ملاحظة: مع التبرير المناسب ، تحصل بعض المختبرات على إذن لإجراء قطع الرأس الحي من أجل تقليل العمليات السامة للإثارة قدر الإمكان وتعزيز صلاحية الخلية.
9. قم بإجراء التشريح.
   ملاحظة: يجب استخراج الدماغ بسرعة (<45 ثانية).
   1. باستخدام المشرط ، قم بقطع الجلد السطحي أعلى الجمجمة من المنقاري إلى الذيلي.
   2. قشر فروة الرأس على كل جانب من جوانب الرأس.
   3. باستخدام مقص صغير ذو طرف حاد مستقيم ، قم بقص الصفيحة بين الجدارية على طول خياطة lambdoid لإزالة المخيخ. إزالة العظم القذالي.
   4. باستخدام نفس المقص ، قم بقص خياطة السهمية.
   5. حرك ملقط قنية الأوعية الدموية (أو الأنفاق في حالة كسر جمجمة الفئران) أسفل كل عظم جداري واسحبه لكشف الدماغ.
   6. باستخدام ملقط مرقئ منحني ، اضغط على العظام الأمامية لكسرها ، ثم استخدم الملقط أو ملقط قنية الأوعية الدموية لإزالة العظام المكسورة. قص وإزالة الأم الجافية بلطف قدر الإمكان ، حيث يمكن أن تتداخل مع التشريح.
   7. حرك الملعقة أسفل الدماغ واسحبها برفق من الجمجمة. ضعه في حجرة التقطيع (الصينية العازلة) المملوءة مسبقا ب aCSF المثلج. دع الدماغ يبرد لمدة 1-2 دقيقة.
   8. قم بإعداد منصة التشريح عن طريق ملء طبق بتري بالثلج وبعض الماء المثلج للسماح بملامسة أكبر للسطح. غطي الطبق بغطاءه وضعي ورق الترشيح فوقه. بلل ورق الترشيح باستخدام aCSF البارد.
   9. بمجرد أن يبرد الدماغ ، ضع الدماغ على طبق بتري المملوء بالثلج وقم بإجراء التشريح المناسب بسرعة للحصول على مستوى التقطيع المطلوب.
   10. للحصول على شرائح سهمية تحتوي على النواة المتكئة (NAc) ، استخدم شفرة حلاقة أحادية الحافة لقطع وإزالة الدرنات الشمية والمخيخ إذا كانت لا تزال موجودة. بعد ذلك ، قم بإجراء قطع سهمي من 2-3 مم من الحدود الجانبية لنصف الكرة الأيمن للحصول على السطح المسطح الذي سيتم لصقه على لوحة تثبيت العينة (انظر الخطوة 1.8.11).
       ملاحظة: سيسمح قطع 2-3 مم فقط من الحدود الجانبية لنصف الكرة الأرضية بجمع الشرائح التي تحتوي على NAc من نصفي الكرة الأرضية. يعتمد التشريح المناسب على منطقة الدماغ التي يتم فحصها. هنا ، يتم إجراء التشريح بحيث يمكن تسجيل الخلايا العصبية NAc في شرائح الدماغ السهمية.
   قم
   11. بلصق السطح المسطح المقطوع للدماغ بسرعة (باستخدام غراء سيانواكريليت المطبق على لوحة تثبيت العينة) على اللوحة وفقا لمستوى التقطيع المطلوب. للحصول على شرائح الدماغ السهمية ، انظر الخطوة 1.8.10.
   12. ضع على الفور لوحة تثبيت العينة وثبتها في غرفة التقطيع بحيث يتم تقطيع الدماغ إلى شرائح (من أجل السلامة ، قم بإعداد حامل الشفرة فقط عند تأمين لوحة العينة).
   13. اضبط الاهتزاز بمعلمات التقطيع المناسبة (المعلمات المستخدمة في المختبر للاهتزاز المذكورة في المواد: السرعة 3-4 ، الاهتزاز 9-10 ، وسمك الشريحة 250 ميكرومتر).
   14. عند التقطيع ، استخدم ماصة نقل مشذبة بالبلاستيك لنقل شرائح الدماغ إلى غرفة الاسترداد (في RT) (انظر الخطوة 1.3). قد يختلف وقت الشفاء اعتمادا على نوع الخلايا العصبية قيد الدراسة (عادة 30-90 دقيقة).

< p class = "jove_title" >2. تسجيل الماصات الدقيقة وإعداد الحفارة

1. ارجع إلى الإرشادات المحددة لدليل مستخدم المجتذب للحصول على خصائص الماصة الدقيقة المطلوبة.
   ملاحظة: بالنسبة لشبكات MSN، نستخدم نطاق مقاومة الماصة من 3.2 إلى 4.0 MΩ.
2. قم بتزويد aCSF بالأكسجين واضبط التدفق على 2 مل / دقيقة.
3. قم بتشغيل وحدة التحكم في سخان التروية واضبط إعدادات درجة الحرارة من أجل الحصول على درجة الحرارة المطلوبة (على سبيل المثال ، 31.8-32.2 درجة مئوية).
   ملاحظة: يعتمد استقرار درجة الحرارة على وجود مستوى ثابت من aCSF وسرعة تدفق ثابتة في الغرفة. نظرا لأن العديد من الخصائص الفيزيائية الحيوية للخلايا العصبية (على سبيل المثال ، مقاومة المدخلات ، R_i ، وتسمى أيضا مقاومة الغشاء ، R_m) حساسة لدرجة الحرارة ، فمن المهم الحفاظ على درجة حرارة ثابتة.
4. قم بتشغيل مكبر الصوت الذي يتم التحكم فيه بواسطة الكمبيوتر والكاميرا والمناوير الدقيق وضوء الخلفية المجهري. في حالة إجراء تجربة تتطلب التحفيز الكهربائي للأنسجة ، قم بتشغيل وحدة التحكم في التحفيز ووحدة العزل. < / > ملاحظة: توصي بعض مكبرات الصوت من المصنعين الآخرين ب "الإحماء" قبل الاستخدام ، لذلك يوصى بالرجوع إلى الدليل لمعرفة إجراءات التشغيل الدقيقة.
5. ابدأ التقاط الكاميرا والحصول على الإشارات وبرنامج مكبر الصوت.
6. وضع الشريحة والتصور:
   1. باستخدام ماصة نقل بلاستيكية ذات طرف مشذب ، اسحب شريحة واحدة من الدماغ برفق من غرفة الاسترداد.
   2. ضع ماصة النقل في غرفة التسجيل واضغط برفق على شريحة الماصة على زلة الغطاء المبطنة لقاع الغرفة.
      ملاحظة: طالما لا يحدث فائض ، فمن غير الضار أن ينسكب بعض aCSF من غرفة الاسترداد في الحمام.
   3. استخدم الملقط لتغيير موضع الشريحة بحيث يتم وضع المنطقة المطلوبة بالضبط في وسط غرفة التسجيل. استخدم العدسة الموضوعية منخفضة الطاقة (4X) المجهرية والعدسة للمساعدة في تحديد الموضع.
   4. بعد تحقيق الموضع المطلوب ، قم بتأمين موضع شريحة الدماغ باستمرار شريحة (تعرف أيضا باسم "القيثارة") في الغرفة.
   5. قم بالتبديل إلى العدسة الموضوعية عالية الطاقة (40X) وخفضها برفق حتى يتم تكوين ملامسة مع aCSF في الغرفة.
   6. استخدم عجلة الضبط الدقيقة لتركيز المنديل. أثناء ملامستك ل aCSF ، لا تستخدم عجلة الضبط الخشنة على المجهر لأن خفض العدسة الموضوعية بشكل مفرط يمكن أن يؤدي إلى سحق الشريحة أو حتى كسر انزلاق الغطاء المبطن في قاع الغرفة ، مما قد يتسبب في انسكاب aCSF على المكثف وإتلافه.
   7. عندما يكون التركيز على مستوى الأنسجة ، راقب الخلايا في المنطقة المستهدفة للشكل. يمكن التعرف على الخلايا الميتة بسهولة من خلال غشاء البلازما المنتفخ والنواة (الشكل 1E). يجب أن تظهر الخلايا السليمة على شكل هياكل متجانسة مستديرة أو بيضاوية أو بيضاوية الشكل (الشكل 1 ه).
   8. ابحث عن خلية مستهدفة. ضع علامة عليها على شاشة الكمبيوتر للمساعدة في توجيه الماصة الدقيقة التسجيل. إذا كنت تستخدم برنامجا مثل QCapture ، فقم برسم مربع حول الخلية المستهدفة عن طريق الضغط باستمرار على النقر بالماوس الأيسر.
   9. ارفع العدسة الموضوعية بحيث تكون هناك مساحة كافية في المخروط المتكون من العدسة الشيئية الملامسة ل aCSF لوضع الماصة الدقيقة للتسجيل وتحريكها.
7. وضع الماصات الدقيقة وتحديد المواقع
   1. باستخدام حقنة سعة 1 مل ، وإبرة حقنة غير معدنية ، ومرشح مخصص ، املأ ماصة دقيقة بالمحلول الداخلي المعد مسبقا وفقا للتجربة المخطط لها (محلول داخلي قائم على K ⁺ أو Cs ⁺ ، انظر المواد للتكوين). استخدم محلولا كافيا حتى يتلامس المحلول الداخلي مع قطب السلك الفضي المطلي بالكلوريد داخل حامل الماصة الدقيقة. < / > ملاحظة: يمكن معالجة قطب السلك الفضي بالكلور عن طريق نقعه في المبيض المنزلي. يمكن إضافة ثلاثي الفوسفات النيوكليوزيدي (أدينوسين ثلاثي الفوسفات ، ATP & غوانوزين ثلاثي الفوسفات ، GTP) إلى المحلول الداخلي قبل الاستخدام. احتفظ بالمحقنة التي تحتوي على المحلول على الثلج لمنع تدهور ATP / GTP.
   2. تأكد من عدم وجود فقاعات هواء في الماصة الدقيقة حيث يمكن أن تخرج أثناء وجود الماصة الدقيقة في الأنسجة وتحجب الشريحة.
   3. ضع الماصة الدقيقة في حامل القطب الكهربائي بحيث يتلامس المحلول مع قطب السلك المطلي بكلوريد الفضة.
   4. شد غطاء الماصة بحيث تشكل الغسالة المخروطية ختما حول الماصة الدقيقة.
   5. استخدم ضغطا إيجابيا قبل غمر الماصة الدقيقة في aCSF لمنع الحطام من دخول الماصة.
   6. ضع الرأس في وضع القفل (في مواجهة الغرفة) ، وباستخدام المعالج الدقيق ، قم بتوجيهه لأسفل نحو الغرفة بحيث يكون تقريبا تحت مركز الهدف المغمور.
   7. أثناء تحريك الماصة الدقيقة باستخدام الملاعب الدقيقة (المضبوطة على سرعة متوسطة إلى عالية)، استخدم شاشة الكمبيوتر لتحديد موقع الماصة الدقيقة وتوجيهها نحو موقع الخلية على المحور XY.
   8. قم بقياس مقاومة الماصة الدقيقة عن طريق تطبيق خطوة جهد (على سبيل المثال، 4 مللي فولت لمدة 100 مللي ثانية)، والتي يمكن تحقيقها يدويا أو تلقائيا عبر برنامج محدد مثل وضع "الحمام" في حالة استخدام "اختبار الغشاء" في برنامج Clampex (انظر أيضا الخطوة 4). للتأكد من عدم وجود فقاعات هواء أو أي أجسام غريبة أخرى تسد الماصة الدقيقة ، قم بالضغط الإيجابي باستخدام المحقنة المملوءة بالهواء (على سبيل المثال ، حقنة 30 سم مكعب) المتصلة بحامل الماصة الدقيقة بأنابيب البولي إيثيلين.
   9. بعد مسح الماصة الدقيقة ، قم بإجراء إزاحة الجهد لتقليل تيار الماصة إلى الصفر ، والذي يمكن تحقيقه يدويا أو عبر برنامج محدد مثل "إزاحة الماصة" على قائد مكبر الصوت الذي يتم التحكم فيه بواسطة الكمبيوتر.
      ملاحظة: ستعوض هذه الوظيفة عن أي جهد ناتج عن اختلافات التركيز بين الحمام ومحاليل الماصة الدقيقة (أي إمكانات الوصلة السائلة).

< p class = "jove_title" >3. اختبار الغشاء

ملاحظة: تنطبق هذه الخطوة على مكبر الصوت المذكور في المواد.

1. عند استخدام قائد مكبر للصوت يتم التحكم فيه بواسطة الكمبيوتر ، قم دائما بضبطه على وضع مشبك الجهد لإجراء اختبار الغشاء. < / > ملاحظة: عندما يتم ضبط اختبار الغشاء في وضع "الحمام"، يسمح اختبار الغشاء بقياس مقاومة الماصة الدقيقة ومقاومة مانع التسرب عند تشكيل مانع التسرب.
2. بمجرد تمزق الغشاء (انظر الخطوة 4.8) ، قم بتبديل اختبار الغشاء إلى وضع "الخلية" بحيث يمكن الحصول على مقاومة السلسلة (R_s) (وتسمى أيضا مقاومة الوصول ، R_a) و R_i وسعة الغشاء (C_p).

4. النهج النهائي ، وتشكيل الختم ، والحصول على تكوين الخلية الكاملة

1. باستخدام عجلة التركيز البؤري الدقيقة، ابدأ التركيز البؤري لأسفل مع خفض الماصة الدقيقة تدريجيا. قم دائما بالتركيز لأسفل أولا ثم اخفض الماصة الدقيقة إلى مستوى التركيز البؤري. سيضمن ذلك عدم اختراق طرف الماصة الدقيقة فجأة في الشريحة.
2. عندما تتلامس الماصة الدقيقة مع سطح الشريحة، قم بإبطاء سرعة المعالج الدقيق إلى الوضع المتوسط إلى المنخفض.
3. قم بالضغط الإيجابي الخفيف برفق باستخدام المحقنة المملوءة بالهواء المتصلة بحامل الماصة لإزالة أي حطام من مسار الاقتراب.
4. اقترب من الخلية إما بالتناوب مع مقابض التحكم XYZ ، أو عن طريق الاقتراب قطريا (إذا كان نموذج المعالج الدقيق يسمح بذلك) حيث يتم تغيير كلا محوري XZ مع دوران مقبض المحور Z. الطريقة الأخيرة ستمنع الضغط الرأسي للأنسجة. < / > ملاحظة: هنا ، الهدف هو الاقتراب من الخلية عن طريق إلحاق الحد الأدنى من الضرر بالشريحة. عندما تكون الماصة الدقيقة قريبة بدرجة كافية من الخلية ، تظهر غمازة (تغير دائري في لون سطح الخلية ناتج عن الضغط الإيجابي المطبق عبر طرف الماصة الدقيقة) (الشكل 2).
5. عندما تظهر الغمازة (الشكل 2-1)، قم بتطبيق شفط ضعيف وقصير من خلال الأنبوب المتصل بأنبوب شفط حامل الماصة من أجل إنشاء مانع التسرب (الشكل 2-2). استمر في مراقبة اختبار الغشاء.
   ملاحظة: إذا تم تشكيل ختم جزئي (<1 GΩ) ، فإن حقن التيارات السالبة عن طريق خفض إمكانات التثبيت (على قائد مكبر الصوت الذي يتم التحكم فيه بواسطة الكمبيوتر) يمكن أن يسهل تكوين مانع التسرب والوصول إلى مقاومة جيجا أوم ("ختم جيجاأوم" أو "جيجاسيل" >1 - 5 جيجاأوم). ستحد المقاومة العالية للختم (>1 GΩ) من تلوث الضوضاء بالإشارة المسجلة وتساهم في الاستقرار الميكانيكي للرقعة.
6. أثناء تكوين gigaseal ، استخدم قائد مكبر الصوت الذي يتم التحكم فيه بواسطة الكمبيوتر لتقريب إمكانات الاحتفاظ بالخلية قدر الإمكان من إمكانات الراحة الفسيولوجية (_{V rest}) من أجل منع التغييرات المفاجئة بمجرد تمزق الغشاء. على سبيل المثال ، عادة ما يتم تثبيت شبكات MSN بالجهد عند -70 أو -80 مللي فولت (_راحة V الفسيولوجية: -70 إلى -90 مللي فولت).
7. بعد تشكيل gigaseal ، عوض عن السعة السريعة والبطيئة يدويا أو تلقائيا. إذا كنت تستخدم وحدة تحكم مكبر للصوت يتم التحكم فيها بواسطة الكمبيوتر مثل وحدة التحكم Multiclamp ، فاضغط على "تلقائي" ل "Cp Fast" و "Cp Slow".
8. إذا ظل الختم مستقرا وأعلى من 1 GΩ (أو حقن أقل من 10-20 باسكال لتثبيت الخلية عند إمكانات الغشاء المطلوبة) ، فقم بتطبيق شفط قصير وقوي من خلال نفس الأنبوب كما في 4.5 لتمزيق غشاء البلازما (الشكل 2-3).
   ملاحظة: قد يستغرق هذا عدة تجارب. يتم تحقيق تمزق جيد للغشاء عندما يتم إجراء الشفط بقوة كافية بحيث لا يسد الغشاء الممزق الماصة الدقيقة (مما قد يؤدي إلى زيادة R_s أثناء التسجيل) ، ولكن بشكل ضعيف بما يكفي حتى لا يسحب جزءا كبيرا من الغشاء أو الخلية.
9. بعد تحقيق تكوين ناجح للخلية بأكملها، راقب موقع الماصة الدقيقة بانتظام لتقييم الانجراف الكبير وتصحيحه لأنه قد يؤدي إلى فقدان الرقعة. قد تختلف سعة الانجراف وفقا لعدة عوامل ، على سبيل المثال ، جودة تركيب الحفارة وقوى السحب على المسرح. من الناحية المثالية ، يجب أن يكون الانجراف معدوما تقريبا.
10. من خلال التبديل إلى وضع "الخلية" في اختبار الغشاء ، اعرض المعلمات المختلفة للخلية مثل R_i و R_s و C_p. راقب هذه المعلمات أثناء التسجيل.
    ملاحظة: يمكن أن تساعد كل هذه المعلمات في تقييم الحالة الصحية الأولية للخلايا وأنواع الخلايا (انظر قسم "اختبار الغشاء" ، الخطوة 4).

النتائج

الشكل 1. غرفة الاسترداد المصممة خصيصا (A-D) وصورة لشريحة دماغية عند 400X تظهر الخلايا العصبية السليمة والميتة (E). A-D) تم وصف إجراء إنشاء غرفة استرداد مخصصة في الخطوة 2.1. ه) صورة ل NAc القشرة الإنسية MSNs في شريحة دماغية عند 400X تظهر أمثلة على الخلايا العصبية السليمة (الأسهم الحمراء) مقابل الخلايا العصبية الميتة (الأسهم الزرقاء). لاحظ أنه على الرغم من الإشارة إلى بعض الخل...

المواد