مقالة منهجية

قياس النشاط الفيزيولوجي الكهربي للشبكات العصبية باستخدام مصفوفات الأقطاب الكهربائية الدقيقة

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Frega، M. et al. التمايز العصبي السريع للخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات لقياس نشاط الشبكة على مصفوفات الأقطاب الكهربائية الدقيقة. J. Vis. Exp. (2017).

يوضح الفيديو كيفية استخدام مصفوفة الأقطاب الكهربائية الدقيقة (MEA) لتسجيل النشاط الفيزيولوجي الكهربي للخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSCs). يتم تسجيل نشاط الفيزيولوجيا الكهربية من MEA متعدد الآبار الذي يحتوي على ثقافة مشتركة للخلايا العصبية والخلايا النجمية للكشف عن إمكانات العمل من الخلايا العصبية المتعددة في الشبكة ، مما يؤكد التمايز الناجح ل hiPSCs إلى خلايا عصبية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
فئة

1. تمايز hiPSCs الإيجابية rtTA / Ngn2 إلى الخلايا العصبية في MEAs ذات 6 آبار وأغطية زجاجية

ملاحظة: في هذا البروتوكول ، يتم توفير التفاصيل للتمييز بين منشط التتراسيكلين العكسي المتحكم فيه (rtTA) / Neurogenin-2 (Ngn2) hiPSCs الإيجابي على 6 آبار MEAs (أجهزة تتكون من 6 آبار مستقلة مع 9 تسجيل و 1 أقطاب كهربائية مرجعية مدمجة لكل بئر).

  1. إعداد الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف (اليوم 0 واليوم 1)
    1. في اليوم السابق لبدء التمايز ، قم بتعقيم MEAs وفقا لتوصية الشركة المصنعة.
    2. قم بتخفيف بروتين الالتصاق Poly-L-Ornithine (PLO) في ماء معقم فائق النقاء إلى تركيز نهائي 50 ميكروغرام / مل. قم بتغطية مساحة القطب النشط للMEAs ذات 6 آبار عن طريق وضع قطرة 100 ميكرولتر من PLO المخفف في كل بئر.
    3. احتضان المتوسط البيئي المتوسط المتوسط المكونة من 6 آبار بين عشية وضحاها (O / N) في حاضنة رطبة 37 درجة مئوية مع جو 5٪ من ثاني أكسيد الكربون2. في اليوم التالي ، استنشق منظمة التحرير الفلسطينية المخففة. اغسل الأسطح الزجاجية للمناطق المتوسطة والمتوسطة المكونة من 6 آبار مرتين بماء معقم فائق النقاء.
    4. خفف اللامينين في خليط النسر المتوسط / المغذيات المعدل من Dulbecco البارد F-12 (DMEM / F12) إلى تركيز نهائي يبلغ 20 ميكروغرام / مل. قم على الفور بتغطية منطقة القطب النشط للمتوسطات البيئية المكونة من 6 آبار عن طريق وضع قطرة 100 ميكرولتر في كل بئر.
    5. احتضان المتوسطيات البيئية المكونة من 6 آبار في حاضنة رطبة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية مع جو 5٪ من ثاني أكسيد الكربون2 لمدة ساعتين على الأقل.
  2. لوحة hiPSCs (اليوم 1)
    ملاحظة: تفترض الأحجام المذكورة في الخطوات 1.2.1 - 1.2.4 أن hiPSCs الإيجابية rtTA / Ngn2 يتم زراعتها في صفيحة من 6 آبار وأن خلايا بئر واحد يتم حصادها. تعتمد الأحجام المطلوبة لطلاء الخلايا على المتوسطيات البيئية المكونة من 6 آبار على عدد المتوسطات البيئية ذات 6 آبار المستخدمة في التجربة. تسمح الأرقام المحددة في الخطوات 1.2.6 - 1.2.8 بالقياس إلى أحجام تجربة مختلفة.
    1. DMEM / F12 دافئ ، محلول انفصال الخلية (CDS) ووسط E8 مع 1٪ (v / v) البنسلين / الستربتومايسين إلى R / T. أضف الدوكسيسيكلين إلى التركيز النهائي البالغ 4 ميكروغرام / مل ومثبط بروتين كيناز (ROCK) المرتبط بالrho إلى وسط E8.
    2. استنشق الوسط المستهلك لمركبات hiPSCs الإيجابية rtTA / Ngn2 وأضف 1 مل CDS إلى hiPSCs. احتضان 3-5 دقائق في حاضنة رطبة 37 درجة مئوية مع جو 5٪ ثاني أكسيد الكربون2. تحقق تحت المجهر مما إذا كانت الخلايا تنفصل عن بعضها البعض.
    3. أضف 2 مل DMEM/F12 في البئر، الخلايا برفق باستخدام ماصة سعة 1,000 ميكرولتر وانقل الخلايا إلى أنبوب سعة 15 مل. أضف 7 مل DMEM/F12 إلى تعليق الخلية. قم بتدوير الخلايا عند 200 × جم لمدة 5 دقائق.
    4. استنشق المادة الطافية وأضف 2 مل من وسط E8 المحضر. افصل hiPSCs عن طريق وضع طرف ماصة سعة 1,000 ميكرولتر على جانب الأنبوب سعة 15 مل وإعادة تعليق الخلايا برفق. تحقق تحت المجهر مما إذا كانت الخلايا منفصلة.
    5. تحديد عدد الخلايا (الخلايا / مل) باستخدام غرفة مقياس الدم.
      ملاحظة: عادة ما ينتج عن بئر الصفيحة المكونة من 6 آبار عند التقاء 80-90٪ 3.0 - 4.0 ×10 6 خلايا في المجموع.
    6. استنشق اللامينين المخفف. بالنسبة للمناطق المتوسطية والمتوسطة المكونة من 6 آبار ، قم بتخفيف الخلايا للحصول على تعليق خلوي يبلغ 7.5 × 105 خلايا / مل. قم بإضافة قطرة 100 ميكرولتر من تعليق الخلية على منطقة القطب النشط في كل بئر من المجالات المتوسطة الحجم المكونة من 6 آبار.
    7. ضع المتوسطات البيئية المكونة من 6 آبار في حاضنة رطبة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية مع جو 5٪ من ثاني أكسيد الكربون2 لمدة ساعتين.
    8. بعد ساعتين ، أضف بعناية 500 ميكرولتر من وسط E8 المحضر إلى كل بئر من المتوسط البيئي المكون من 6 آبار. ضع 6 آبار MEAs O / N في حاضنة رطبة 37 درجة مئوية مع جو من 5٪ CO2.
  3. تغيير الوسيط (اليوم 2)
    1. في اليوم التالي، قم بإعداد DMEM/F12 مع 1٪ (حجم/حجم) من مكمل N-2، و1٪ (حجم/حجم) من الأحماض الأمينية غير الأساسية، و1٪ (حجم/حجم) البنسلين/الستربتومايسين. يضاف التغذية العصبية المؤتلفة البشرية -3 (NT-3) إلى التركيز النهائي البالغ 10 نانوغرام / مل ، والعامل العصبي المؤتلف المشتق من الدماغ البشري (BDNF) إلى التركيز النهائي البالغ 10 نانوغرام / مل ، والدوكسيسيكلين إلى التركيز النهائي البالغ 4 ميكروغرام / مل. قم بتسخين المتوسط إلى 37 درجة مئوية.
    2. أضف اللامينين إلى التركيز النهائي البالغ 0.2 ميكروغرام / مل إلى الوسط. تصفية الوسيط الناتج. استنشق الوسط المستهلك من آبار المتوسط المتوسط المتوسط المكون من 6 آبار واللوحة المكونة من 24 بئرا واستبدله بالوسط المحضر. احتضان 6 آبار MEAs O / N في حاضنة رطبة 37 درجة مئوية مع جو 5٪ من ثاني أكسيد الكربون.
  4. أضف الخلايا النجمية للفئران (اليوم 3)
    ملاحظة: تفترض المجلدات المذكورة في هذا البروتوكول أن الخلايا النجمية للفئران يتم استزراعها في قوارير ثقافة T75. من الأهمية بمكان أن تكون الخلايا النجمية للفئران التي تضاف إلى الثقافات ذات نوعية جيدة. نستخدم معيارين للتحقق مما إذا كانت الخلايا النجمية للفئران ذات نوعية جيدة. أولا ، يجب أن تكون ثقافة الخلايا النجمية للفئران قادرة على النمو في غضون عشرة أيام بعد العزلة عن أدمغة الفئران الجنينية. ثانيا ، بعد تقسيم ثقافة الخلايا النجمية للفئران ، يجب أن تكون الخلايا النجمية للفئران قادرة على تكوين طبقة أحادية التقاء والفسيفساء. إذا كانت ثقافة الخلايا النجمية للفئران لا تفي بهذين المعيارين ، فإننا ننصح بعدم استخدام هذه الثقافة لتجارب التمايز.
    1. قم بتسخين 0.05٪ تريبسين - حمض إيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) إلى RT. قم بتسخين محلول ملحي مخزن بالفوسفات (DPBS) و DMEM / F12 من Dulbecco مع 1٪ (حجم / حجم) بنسلين / ستربتومايسين إلى 37 درجة مئوية.
    2. استنشق الوسط المستهلك لثقافة الخلايا النجمية للفئران. اغسل المزرعة بإضافة 5 مل DPBS وحركها برفق.
    3. شفط DPBS وأضف 5 مل 0.05٪ تريبسين-EDTA. حفي التربسين EDTA برفق. احتضن في حاضنة رطبة 37 درجة مئوية مع جو 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 5 - 10 دقائق.
    4. تحقق تحت المجهر مما إذا كانت الخلايا منفصلة. افصل الخلايا الأخيرة عن طريق ضرب القارورة عدة مرات.
    5. أضف 5 مل من DMEM / F12 إلى القارورة. قم بتقطيع الخلايا برفق داخل القارورة باستخدام ماصة سعة 10 مل. اجمع معلق الخلية في أنبوب سعة 15 مل. قم بتدوير الأنبوب عند 200 × جم لمدة 8 دقائق.
    6. استنشق المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 1 مل من DMEM / F12. حدد عدد الخلايا (خلايا / مل) باستخدام غرفة مقياس الدم.
    7. أضف 7.5 × 104 خلايا نجمية لكل بئر من المتوسط المتوسط المتوسط المتوسط المكون من 6 آبار. احتضان MEAs O / N في حاضنة رطبة 37 درجة مئوية مع جو من 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
  5. تغيير الوسيط (اليوم 4)
    1. تحضير الوسط العصبي القاعدي مع 2٪ (حجم / حجم) مكمل B-27 ، و 1٪ (حجم / حجم) L-alanyl-L-glutamine و 1٪ (v / v) بنسلين / ستربتومايسين. أضف NT-3 إلى التركيز النهائي البالغ 10 نانوغرام / مل ، BDNF إلى التركيز النهائي 10 نانوغرام / مل ، والدوكسيسيكلين إلى التركيز النهائي 4 ميكروغرام / مل. بالإضافة إلى ذلك ، أضف السيتوزين β-D-arabinofuranoside بتركيز 2 ميكرومتر
      ملاحظة: يضاف السيتوزين β-D-arabinofuranoside إلى الوسط لمنع تكاثر الخلايا النجمية وقتل hiPSCs المتبقية التي لا تتمايز إلى خلايا عصبية.
    2. قم بتصفية الوسط والدافئ إلى 37 درجة مئوية. قم بشفط الوسط المستهلك من آبار MEAs المكونة من 6 آبار واستبدله بالوسط المحضر. حافظ على المتوسط البيئي المتوسط المتوسط المكونة من 6 آبار في حاضنة رطبة 37 درجة مئوية مع جو 5٪ من ثاني أكسيد الكربون2.
  6. قم بتحديث الوسط (اليوم 6 - 28)
    ملاحظة: بدءا من اليوم 6 ، قم بتحديث نصف الوسيط كل يومين. من اليوم 10 فصاعدا ، يتم استكمال الوسط بمصل الأبقار الجنيني (FBS) لدعم صلاحية الخلايا النجمية للبقاء.
    1. تحضير الوسط العصبي القاعدي مع 2٪ (حجم / حجم) مكمل B-27 ، و 1٪ (حجم / حجم) L-alanyl-L-glutamine و 1٪ (v / v) بنسلين / ستربتومايسين. أضف NT-3 إلى التركيز النهائي البالغ 10 نانوغرام / مل ، BDNF إلى التركيز النهائي 10 نانوغرام / مل ، والدوكسيسيكلين إلى التركيز النهائي 4 ميكروغرام / مل. من اليوم 10 فصاعدا، استكمل الوسيط أيضا بنسبة 2.5٪ (v/v) FBS. قم بتصفية الوسط الناتج ودافئه إلى 37 درجة مئوية.
    2. قم بإزالة نصف الوسط المستهلك من آبار المتوسط المتوسط المكون من 6 آبار باستخدام ماصة سعة 1000 ميكرولتر واستبدله بالوسط المحضر. حافظ على المتوسط البيئي المتوسط المتوسط المكونة من 6 آبار في حاضنة رطبة 37 درجة مئوية مع جو 5٪ من ثاني أكسيد الكربون2.
< p class = "jove_title" >2. إنشاء الملف الفيزيولوجي العصبي للخلايا العصبية المشتقة من hiPSC

ملاحظة: بعد أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع من تحريض التمايز ، يمكن استخدام الخلايا العصبية المشتقة من hiPSC لتحليلات مختلفة في المصب في هذا القسم ، يتم إعطاء أمثلة لبعض التحليلات النهائية التي يمكن إجراؤها لتحديد الملف الفيزيولوجي العصبي للخلايا العصبية المشتقة من hiPSC.

  1. توصيف نشاط الشبكة العصبية باستخدام الاتفاقات البيئية
    1. سجل 20 دقيقة من النشاط الفيزيولوجي الكهربي للخلايا العصبية المشتقة من hiPSC المزروعة على MEAs. أثناء التسجيل ، حافظ على درجة الحرارة عند 37 درجة مئوية ، ومنع التبخر وتغيرات الأس الهيدروجيني للوسط عن طريق تضخيم تدفق مستمر وبطيء للغاز المرطب (5٪ CO2 ، 20٪ O2 ، 75٪ N2) على MEA.
    2. بعد التضخيم 1200X (MEA 1060 ، MCS) ، قم بأخذ عينة من الإشارة عند 10 كيلو هرتز باستخدام بطاقة الحصول على بيانات MCS. تحليل البيانات (اكتشاف الارتفاع والانفجار) باستخدام حزمة برامج مخصصة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مكمل B-27 جيبكو 0080085 SA 0.05 ٪ تريبسين EDTA جيبكو هاتف: 25300-054 DMEM عالي الجلوكوز جيبكو 11965-092 FBS سيجما ألدريتش F2442-500 مل البنسلين / الستربتومايسين سيجما ألدريتش ص 4333 DPBS جيبكو 14190-094 DMEM / F12 جيبكو 11320-074 حل انفصال الخلية سيجما ألدريتش أ6964 E8 متوسط جيبكو A1517001 مثبط الصخور جيبكو A2644501 بدلا من ذلك ، يمكن استخدام مثبطات ROCK مثل الثيازوفيفين. 6-الآبار المتوسطية المتوسطية أنظمة متعددة القنوات 60-6wellMEA200 / 30iR-Ti-tcr بولي إل أورنيثين سيجما ألدريتش P3655-10 ملغ لامينين سيجما ألدريتش L2020-1MG مكمل N-2 جيبكو 17502-048 الأحماض الأمينية غير الأساسية سيجما ألدريتش M7145 NT-3 ، مؤتلف بشري بروموكين ج 66425 BDNF ، مؤتلف بشري بروموكين ج 66212 التربسين EDTA جيبكو هاتف: 25300-054 L-alanyl-L-جلوتامين جيبكو 35050-038 الوسط العصبي القاعدي جيبكو هاتف: 21103-049 السيتوزين β-د-أرابينوفورانوسيد سيجما ألدريتش C1768-100 ملغ

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة