مقالة منهجية

تسجيلات Patch-Clamp من التغصنات لخلية عصبية دوبامين في شريحة الدماغ

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Engel ، D. تسجيلات مشبك التصحيح دون الخلوية من المجال الجسدي للتوترات العصبية الدوبامين Nigral. J. Vis. Exp. (2016).

يوضح هذا الفيديو تقنية لتسجيل مشبك التصحيح من سطح الغشاء المتغصن. يساعد هذا على فحص الخصائص الكهربائية للتشعبات والقنوات الأيونية الأساسية ذات الجهد الكهربائي في الخلايا العصبية الدوبامينية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. إعداد الحلول

  1. السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي القياسي (ACSF; الجدول 1)
    1. استخدم أملاحا عالية النقاء وأكواب زجاجية نظيفة تم شطفها مسبقا بالماء المقطر المزدوج لتحضير محلول جديد. استخدم الماء المقطر المزدوج عالي الجودة لتحضير جميع المحاليل خارج الخلايا وداخلها.
    2. وفقا للجدول 1 ، خذ دورق سعة 2 لتر لإذابة NaHCO3 في 500 مل من الماء وآخر لإذابة الأملاح الأخرى لمنع ترسيب الأيونات ثنائية التكافؤ. نظف الملعقة بانتظام بالماء المقطر المزدوج وجففها قبل تناول الملح. استخدم أداة التحريك المغناطيسي لتجانس الذوبان. أضف المحاليل من كلا الكؤوب إلى قارورة حجمية مناسبة وقم بإحضارها إلى الحجم المناسب.
    3. تأكد من أن المحلول النهائي خارج الخلية شفاف تماما وبدون أي أثر لهطول الأمطار.
    4. ضع خليطا غازيا يتكون من 95٪ O2 و 5٪ CO2 (غاز الكربوجين) مع شمعة مرشح زجاجي (Ø 13 مم) قبل 20 - 30 دقيقة من نقع الشرائح. تحكم بعناية في الأسمولية (2-3 قياسات متتالية) ل ACSF باستخدام مقياس التناضح (النطاق الأمثل: 314 - 325 مللي أسمول / لتر). قم بتخزين المحلول المتبقي بعد التحضير على حرارة 4 درجات مئوية واستخدمه في غضون 3 أيام.
  2. محلول القطع (السكروز-ACSF; الجدول 2)
    1. تحضير 3 لتر من المحلول الطازج. استخدم 1 لتر لتحضير شرائح الدماغ من واحد. قم بتخزين المحلول المتبقي في 4 درجات مئوية واستخدمه في غضون 3 أيام.
      ملاحظة: يتم استخدام تركيزات عالية من المغنيسيوم2+ ومنخفضة من Ca2+ لتقليل الانتقال المشبكي ، ويتم استبدال بعض كلوريد الصوديوم بالسكروز للحفاظ على الأنسجة.
  3. المحاليل داخل الخلايا
    1. قم بإعداد محلول 100 مل مسبقا للتسجيلات المزدوجة للخلايا الكاملة (الجدول 3).
    2. قم بتضمين ميثيل كبريتات للحصول على انتعاش جيد لتشكل الخلايا. أضف biocytin (0.1 - 0.4٪) لفحص مورفولوجيا الخلايا العصبية لاحقا. قم بتضمين صبغة فلورية (على سبيل المثال ، Alexa 594 أو Sulforhodamine 101 41) لمتابعة امتداد التشعبات أثناء التسجيل (اختياري).
    3. قم بإعداد محلول قطب كهربائي سعة 100 مل مسبقا للتسجيلات المتصلة بالخلايا (الجدول 4). في هذه الحالة ، يكون الحل الداخلي عبارة عن حل عالي K + مصمم لعزل التيار الكاتيوني المنشط بفرط الاستقطاب العياني (Ih) ويحتوي على حاصرات للقنوات الأيونية الأخرى ذات الجهد الكهربائي.
    4. قم بتخزين المحاليل داخل الخلايا في حصصات 2 مل عند -20 درجة مئوية. استخدم حصة جديدة لكل جلسة تسجيل جديدة. تحقق من الأسمولية لكل حصة مذابة بعناية باستخدام مقياس التناضح. خذ حصة جديدة إذا كانت الأسمولية لا تتوافق مع القيمة الأولية.
    5. انقل المحلول من اللقب إلى حقنة سعة 3 مل يتم وضع مرشح حقنة معقمة بحجم 0.22 ميكرومتر فوقها. احتفظ بالمحقنة على الجليد أثناء جلسة التسجيل للحد من تدهور مركباتها (ATP أو GTP أو phosphocreatine).
فئة

2. تصنيع وتعبئة ماصة التصحيح

  1. سحب
    1. استخدم مجتذب قطب كهربائي أفقي وأنابيب زجاجية من البورسليكات سميكة الجدران. بالنسبة للتسجيلات الكاملة للخلايا والخلية ، استخدم قطرا خارجيا 2 مم / قطر داخلي 1 مم. تأكد من أن الأنبوب الزجاجي نظيف تماما.
    2. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقم بغمر الشعيرات الدموية الزجاجية في مذيب عضوي (على سبيل المثال ، الإيثانول) أولا ثم في الماء المقطر المزدوج. قم بتسخين النهايات الشعرية لفترة وجيزة باستخدام موقد بنسن. بدلا من ذلك ، اطلب الأنابيب الزجاجية التي يتم غسلها وتسخينها مباشرة من الشركة المصنعة (انظر قائمة المواد).
    3. بالنسبة للتسجيلات الجسدية المتغصنة المزدوجة، تأكد من أن مقاومة الماصة الجسدية تتراوح بين 6 و10 MΩ وبين 8 و19 MΩ للماصات المتغصنة عند ملؤها بمحلول داخل الخلايا (الجدول 3). توحيد مقاومة الماصة للتسجيلات المتصلة بالخلايا بمقاومة 10 MΩ لتحقيق نتائج قابلة للمقارنة على طول المجال الجسدي للتغصنات الجسدية للخلايا العصبية.
    4. قم بإعداد ماصات جديدة قبل كل جلسة تسجيل (كل يوم) أو قبل الترقيع مباشرة واستخدمها بعد 5-8 ساعات من تصنيعها. قم بتخزين الماصات في وعاء زجاجي مغطى لحمايتها من الغبار وانسداد الطرف.
  2. تلميع
    1. افحص وتلميع كل طرف ماصة بالحرارة باستخدام مدقة دقيقة للحصول على أختام أفضل مع الغشاء. قبل استخدام microforge ، قم بإذابة قطعة صغيرة من الزجاج على خيوط التسخين البلاتينية. استبدل هذا الطلاء الزجاجي على خيوط البلاتين يوميا من أجل الثبات (بيتر جوناس ، الاتصال الشخصي).
      ملاحظه: يمكن طلاء الماصات المستخدمة في التسجيلات المتصلة بالخلايا قبل خطوة التلميع الحراري لتقليل ضوضاء الخلفية. يمكن استخدام عامل عازل مثل شمع الأسنان المصهور أو المطاط الصناعي السيليكوني لتغطية الماصات.
< p class = "jove_title" >3. تحضير شرائح الدماغ

  1. استخدم فئران الويستار الصحية التي تتراوح أعمارها بين 16 و 19 يوما. لا تستخدم أو غير الصحية التي تعاني من انخفاض حرارة الجسم أو الجفاف. قبل البدء في إعداد الشرائح ، احتفظ بالحيوان في مكان آمن وصامت. تجنب وجود أي آخر في الغرفة أثناء تحضير. تلاعب بالحيوانات بلطف.
  2. صب السكروز-ACSF في كوبين من مادة البولي بروبيلين (PP) سعة 400 مل وضعها في الفريزر -80 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة. امزج المحلول للحصول على محلول سائل مثلج / مجمد متجانس وضع الأكواب على الثلج. قم بتزويد محلول السكروز-ACSF بغاز الكربوجين باستخدام شمعة مرشح دقيق (Ø 13 مم) في كل دورق PP.
  3. تحضير القطاعة والغرفة الاحتياطية
    1. استخدم قطاعة مناديل عالية الجودة ذات اهتزازات رأسية منخفضة للغاية لتقليل الضرر الذي يلحق بالطبقات السطحية للشرائح قدر الإمكان. قم بإصلاح شفرة حلاقة جديدة وكاملة على آلة التقطيع.
    2. استخدم شفرة حلاقة جديدة لكل جلسة قطع. تجنب ثني شفرة الحلاقة. لا تقم بإزالة الفيلم الدهني الموجود على سطح شفرة الحلاقة (جوزيف بيشوفبرغر ، اتصال شخصي).
    3. إذا كان ذلك متاحا ، تحقق من الاهتزاز الرأسي باستخدام مسبار اهتزازي مقدم من الشركة المصنعة. بدلا من ذلك ، استخدم مسبار اهتزازي مخصص. قلل الاهتزازات الرأسية للشفرة بحيث تكون أقرب ما يمكن إلى 0 ميكرومتر.
    4. تحضير غرفة احتياطية سعة 150 مل للشرائح. صب ACSF القياسي في الغرفة الاحتياطية وضعه في حمام مائي. قم بتزويد محلول الغرفة الاحتياطية بالكربوجين باستخدام شمعة مرشح دقيق (Ø 6 مم). تأكد من أن فقاعات الكربوجين صغيرة قدر الإمكان.
      ملاحظه: قم ببناء غرفة احتياطية جديدة كل 2-3 أشهر للحفاظ على جودة الشريحة ثابتة.
  4. قطع شرائح
    1. في غرفة صامتة لا ينزعج فيها المجرب أو يتعرض للتوتر ، اقطع رأس بمقص الجراحة (بطول 150 مم) على مستوى النخاع العنقي.
    2. اقطع الجلد الموجود في الجزء العلوي من رأس في الأنف إلى الاتجاه الذيلي بمشرط وقم بإزالته بشكل جانبي. اقطع الجزء العلوي من الجمجمة من الذيلية إلى الجزء الأنفي من الرأس بمقص ناعم وقم بإزالة كلا الجزأين من الجمجمة بشكل جانبي. قم بإزالة الدماغ بملعقة رفيعة وقم بإسقاطه بعناية في دورق PP يحتوي على مثلج بارد (0-4 درجات مئوية) سكروز ACSF متوازن مع الكربوجين.
      ملاحظه: يجب القيام بهذا التسلسل من الخطوات في أسرع وقت ممكن ، ولكن أيضا بدقة (<<1 دقيقة ، حوالي 40 ثانية).
    3. احتفظ بالدماغ في محلول دورق PP لمدة ~ 2 إلى 5 دقائق. اضبط ضغط الكربوجين لمنع حركات الدماغ. إذا كانت فقاعات الكربوجين كبيرة جدا ، فاستبدل شمعة الفلتر الدقيق بأخرى جديدة.
    4. ضع الدماغ على طبق بتري مقاس 9 سم قاعه الداخلي مغطى بطبقة سيلجارد بسمك ~ 0.5 سم. قم بإعداد طبق بتري هذا مسبقا.
    5. أحط الدماغ بالسكروز المثلج-ACSF. تأكد من أن بعض المراحل السائلة من محلول ACSF - السكروز تغمر الدماغ. بالنسبة للشرائح الإكليلية، اقطع الجزء الأمامي من الدماغ في المستوى الإكليلي بمشرط أو شفرة حلاقة. قم بإزالة المخيخ بقطع إكليلي.
    6. ضع غراء سيانواكريليت على صينية العينات (المساحة ~ 1 سم2). الصق كتلة الدماغ بحيث يواجه الجزء الأمامي مرحلة التقطيع. قم بتقطير السكروز ACSF بعناية فوق الدماغ الملصق باستخدام الفتحة الكبيرة لماصة باستور الزجاجية ثم اغمر ببطء غرفة القطع في آلة التقطيع. قم بمناورة صينية العينات بحيث يكون سطح القطع (أي النسيج الأول الذي يصطدم بالشفرة) هو السطح البطني للدماغ.
    7. ضع الكربوجين مع شمعة مرشح زجاجي منحني (Ø 6 مم) على غرفة القطع (اختياري).
    8. اضبط شفرة الحلاقة بزاوية ~ 15 درجة بالإشارة إلى المستوى الأفقي. قطع شرائح الدماغ الإكليلية من ~ 500 ميكرومتر في الاتجاه الذيلي إلى الأنف قبل الوصول إلى المادة السوداء. قلل السماكة لقطع شرائح بسمك 300 - 350 ميكرومتر تحتوي على منطقة الاهتمام.
    9. افصل الشرائح عن كتلة الأنسجة بإبرة نضح رفيعة جدا متصلة بحقنة موازية لحافة شفرة الحلاقة. ثني الإبرة بحيث يكون لها زاوية 90 درجة بين الإبرة والحقنة. تأكد من عدم الضغط على شفرة الحلاقة أثناء إزالة الشريحة من كتلة الأنسجة.
  5. تخزين الشرائح
    1. انقل الشرائح باستخدام أكبر فتحة لماصة باستور زجاجية (متصلة بلمبة) إلى الغرفة الاحتياطية. بمجرد نقل جميع الشرائح إلى غرفة الاحتياطي (كريستوف شميدت هيبر ، اتصال شخصي) ، ارفع درجة حرارة الحمام المائي إلى 34 درجة مئوية لمدة 0.5 - 1 ساعة.
    2. بعد هذه الفترة ، قم بإيقاف تشغيل الحمام المائي واحتفظ بالشرائح في درجة حرارة الغرفة. اضبط ضغط الكربوجين لتجنب تحركات الشرائح في الغرفة الاحتياطية. احتفظ بالشرائح لمدة 10 إلى 20 دقيقة أخرى قبل بدء التسجيلات.
    3. قم بتنظيف الجهاز وشموع المرشح الدقيق بعناية ولكن بدقة باستخدام الماء المقطر المزدوج في نهاية عملية التقطيع.
< p class = "jove_title" >4. التسجيلات الجسدية المزدوجة والجسدية في الخلايا العصبية Nigral وحفظ Biocytin

  1. اتبع الأوصاف الخاصة بتجميع إعداد مشبك التصحيح للشرائح الواردة في دليل Axon.
  2. تحضير غرفة التسجيل
    1. ضع 1-2 مل من الماء المقطر المزدوج في غرفة التسجيل. تحقق من أنه غير متسرب. ضع حجرة التسجيل على طاولة xy المتغيرة.
    2. قم بتغذية ACSF القياسي من خلال نظام أنابيب التروية غير المنفذة للأكسجين (بولي تترافلورو إيثيلين) إلى غرفة التسجيل. استقرار تدفق التروية في الغرفة بمعدل 4-5 مل في الدقيقة -1. حافظ على طول الأنبوب الذي يربط الدورق الذي يحتوي على ACSF وغرفة التسجيل أقصر ما يمكن (1 متر).
    3. حدد شريحة دماغية من الغرفة الاحتياطية وانقلها إلى غرفة التسجيل باستخدام أكبر فتحة لماصة باستور الزجاجية. قم بتغطية الشريحة بحلقة بلاتينية لتثبيتها في الجزء السفلي من حجرة التسجيل. استخدم حلقة بلاتينية مسطحة (Ø 1.5 سم) وقم بلصق خيوط نايلون متوازية (تباعد >2 مم) عليها.
  3. ضبط البصريات وتحسينها
    1. تصور الشرائح باستخدام الفحص المجهري بالفيديو بالأشعة تحت الحمراء (IR). اضبط إضاءة Köhler 51 وقم بتحسين بصريات تباين التداخل التفاضلي (DIC) أو الإضاءة المائلة (تباين التدرج Dodt - DGC).
    2. تحقق من جودة الشريحة. احتفظ فقط بالشرائح ذات الأسطح الملساء والمتساوية التي لا تتناقض بشدة ولها فوهات صغيرة متناثرة فقط.
    3. املأ 2 ماصة رقعة جديدة وغير مستخدمة بمحلول داخل الخلايا (الجدول 3). استخدم أنبوبا سعة 0.5 مل يحتوي على محلول الماصة لملء طرف الماصة عن طريق عمل الشعيرات الدموية. لتسريع ملء طرف الماصات بدون خيوط، استخدم ضغطا سلبيا على نهاية الماصة باستخدام أنبوب متصل بحقنة.
  4. ضع الماصات فوق سطح الشريحة
    1. تحقق من وجود طلاء كلوريد على الأسلاك الفضية.
    2. أدخل الماصات بالتتابع في حاملات الماصات وقم بالضغط الإيجابي (~70 ملي بار) باستخدام دائرة أنابيب تربط حامل الماصة وصنبور ثلاثي الاتجاهات ومقياس ضغط. اخفض الماصة في حمام غرفة التسجيل.
    3. تأكد من أن قيمة الضغط على مقياس الضغط ثابتة لمدة ~ 1 - 2 دقيقة. إذا كان الضغط يتناقص، فتحقق من الأنبوب أو حلقات O المانعة للتسرب داخل حامل الماصة.
    4. ضع طرف الماصة في منتصف شاشة الفيديو وتأكد من عدم إعاقتها. تأكد من أن طرف الماصة لا يتحرك عند الضغط على الماصة أو إطلاقه.
    5. تحقق من وجود انجراف واهتزازات في طرف الماصة عن طريق رسم صليب صغير في وسط الشاشة بالضبط في موضع طرف الماصة وراقب الحركات المحتملة للطرف لمدة 5 دقائق.
    6. ضع خطوة جهد (5 مللي فولت) لمراقبة مقاومة الماصة على راسم الذبذبات. اضبط إمكانات الاحتفاظ بمضخم التصحيح على 0 مللي فولت. إلغاء إمكانات إزاحة الماصة بحيث يقرأ تيار ماصة التيار المستمر صفرا عند مقياس مكبر الصوت.
    7. حرك الماصات لأسفل إلى الشريحة واحتفظ بها فوق السطح.
  5. تحديد وترقيع خلية عصبية بتشعبات طويلة
    1. داخل المادة السوداء ، حدد خلية عصبية سليمة ذات تشعبات طويلة يمكن متابعتها على مسافة طويلة في نفس المستوى تقريبا (الشكل 1 أ و 1 ب) باستخدام تباين التدرج IR-Dodt (IR-DGC). اختر جسم خلية ناعم ومتجانس. تجنب الخليتين المتناقضتين بشدة على سطح الشريحة (الشكل 1C و 1D) ، لأنه من الصعب اقتحام والحفاظ على ظروف تسجيل مستقرة بمرور الوقت (مقاومة السلسلة المستقرة). حدد الخلايا العصبية التي تحتوي على سوما 10-30 ميكرومتر تحت سطح الشريحة.
    2. حرك القطب الجسدي بالقرب من سوما (40-50 ميكرومتر بعيدا) والقطب الشجيري بالقرب من التغصنات على نفس المسافة. استخدم تكبير 2X (مبدل رباعي الأضعاف) لتحديد جزء من التغصنات وتصحيحه. احصل على شاشة تكبير مطلق قدره 100X 2 بدون تكبير (1X) و5500X بتكبير 2X.
    3. حرر ضغط الماصة الجسدية قليلا بمقدار 10 ملي بار. إذا لزم الأمر، قم بتنظيم ضغط الماصة المتغصنة والجسدية لتجنب إزاحة بنية الخلية (سوما والتغصنات) داخل الشريحة.
    4. ضع الماصة المتغصنة بالقرب من الغشاء لرؤية نقارة صغيرة. حرر الضغط على طرف الماصة وقم بتصحيح التغصنات أثناء التحكم في مقاومة الماصة. في الظروف المثالية ، يكفي شفط طفيف جدا فقط للحصول على ختم جيد.
    5. قلل سعة عابرات سعة الماصة قدر الإمكان أعلى الخطوة الحالية باستخدام نبضة جهد ذات كسب عال وترشيح قليل 51 وراسم الذبذبات. ادخل إلى وضع الخلية بأكملها باستخدام الماصة المتغصنة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجدول 1: السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي (ACSF)

مادة جم / مول تركيز لمدة 1 لتر كلوريد الصوديوم 58.443 دولار 125 ملم 7.305 جرام NaHCO3 84.007 25 ملم 2.100 جرام كيه سي إل 74.551 دولار ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات ماء مقطر مزدوج ميليبور سوبر كيو المقاومة >14 MΩ سم ، مثالية 18.2 MΩ سم عند 25 درجة مئوية ، مفلترة (0.22 ميكرومتر) ، https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Super-Q-Plus-Water-Purification-System,MM_NF-C1760 شموع الفلتر الدقيق روبو المسامية 3 ، 6 مم أو 13 مم القطر قطاعة الأنسجة مع مسبار الاهتزاز لايكا VT1200 معلمات القطع: السرعة 0.07 ، السعة 1.40 قطاعة الأنسجة دوساكا DTK-1000 معلمات القطع: السرعة 4 ، التردد 7 شفرات الحلاقه جيليت سوبر سيلفر أدوات التشريح براون ، أسكولاب غرفة الاحتياط حسب الطلب بيكرز PP VWR 213-1725 400 مل مرشح الحقنة ميرك ميليبور ميليكس - GV 0,22 ميكرومتر الغراء سيانواكريليت UHU "سيكوندن كليبر" الغراء السائل غرفة التسجيل لويغ ونيومان شريحة حجرة صغيرة مجتذب الماصة الأفقي أدوات سوتر براون مشتعل P-97 الماصات هيلجنبرغ 1807524 2 مم OD / 1 مم كابيلاري زجاجية للمعرف ، ينتهي مصقول بالنار ، مغسول شمع الأسنان كولتين / ويلدنت شرائط الشمع صينية تقويم الأسنان الشبكة البلاتينية لتثبيت الشرائح في غرفة التسجيل ، مصنوعة حسب الطلب باستخدام قرص بلاتيني ميكروفورج ناريشيجي مفترة -830 لتلميع أطراف الماصة بالحريق كبريتات ميثيل البوتاسيوم MP الطب الحيوي 215481 بيوسيتين المجسات الجزيئية ب 1592 مقياس الضغط GREISINGER الإلكترونية GDH 13 AN مجهر زييس خ تباين التدرج Dodt لويغ ونيومان المتلاعبين لويغ ونيومان LN ميني 25 ملتقط الإطار مصدر التصوير DFG / USB2pro كاميرا داج - MTI NC-70 المكثف زييس مكثف الفتحة العددية العالية يعمل مع الزيت هدف زييس دبليو خطة Apochromat 441470-9900 VIS-IR تكبير 63 ضعفا ، لمسافات طويلة ، فتحة عددية عالية هدف الغمر في الماء 1.0 مغير رباعي لويغ ونيومان بين الكاميرا والمجهر شاشة فيديو بالأبيض والأسود سوني SSM-175CE 16 بوصة، 850 خط تلفزيون، تناظري زجاجات عينة ، زجاج كهرماني ، مع غطاء VWR 215-2409 لنقل الشرائح من الإعداد إلى غرفة الأنسجة دليل Axon الأجهزة الجزيئية كتاب بارافورمالدهيد سيغما 441244 راجع ورقة بيانات السلامة وتوجيه المواد الخطرة (EU) قبل الاستخدام لوحة ثقافة خلية البئر غرينر بيو ون 662160 [م] لتلوين الشرائح الثابتة تريتون X-100 ميرك 108643 راجع ورقة بيانات السلامة وتوجيه المواد الخطرة (EU) قبل الاستخدام إطالة الماس المضادة للتلاشي المجسات الجزيئية - ثيرمو فيشر العلمي ص36961

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة