تحليل النشاط العصبي في الخلايا العصبية العقدية الحلزونية الأولية للفئران باستخدام مصفوفات متعددة الأقطاب الكهربائية

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Hahnewald، S.، et al. ثقافة الخلايا العصبية العقدية الحلزونية والفيزيولوجيا الكهربية على مصفوفات متعددة الأقطاب الكهربائية. J. Vis. Exp. (2016).

يوضح هذا الفيديو تسجيل النشاط العصبي التلقائي والمعتمد على التحفيز من ثقافات الخلايا العصبية العقدية الحلزونية الأولية للفئران (SGN) على مصفوفة متعددة الأقطاب الكهربائية (MEA). يتضمن غسل وإعداد MEA ، وتسجيل النشاط العصبي التلقائي ، وتطبيق المحفزات الكهربائية الخاضعة للرقابة لتحديد النشاط العصبي المعتمد على التحفيز.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.

< p class = "jove_title" >1. التسجيلات الفيزيولوجية الكهربية للتحقيق في النشاط المعتمد على التحفيز التلقائي والقطب الكهربائي

1. اغسل مزرعة مصفوفة الأقطاب الكهربائية المتعددة (MEA) بمحلول خارج الخلية ، في درجة حرارة الغرفة (RT).
2. جفف جهات الاتصال بمنديل ورقي وقم بتركيب MEA على إعداد MEA.
   ملاحظه: للحفاظ على رطوبة الثقافة أثناء التركيب ، أضف قطرة صغيرة من المحلول خارج الخلية إلى المزرعة.
3. أضف 300 ميكرولتر من المحلول خارج الخلية وانتظر لمدة 10 دقائق قبل التسجيل ، للسماح للنظام بالاستقرار.
4. سجل النشاط التلقائي لمدة دقيقتين من جميع الأقطاب الكهربائية بالضغط على زر التسجيل / الاستحواذ على البرنامج وتحديد أقطاب التسجيل.
5. تحفيز قطب MEA: حدد سعة / مدة / شكل المنبه على البرنامج المناسب وقم بتطبيقه على عدة أقطاب كهربائية على التوالي. حدد الأقطاب الكهربائية بناء على تلك التي تظهر نشاطا تلقائيا (كما في الخطوة 1.4). سجل من جميع الأقطاب الكهربائية المتبقية.
6. لاستبعاد قطعة أثرية للتحفيز ، قم بالتحفيز من نفس القطب 10 مرات. إذا استجابت المزرعة 8 مرات على الأقل من أصل 10 مرات ، فيمكن افتراضها على أنها استجابة إيجابية عند التحفيز الناجم عن القطب.
7. لتحديد ضوضاء الخلفية ، قم بتطبيق السموم الرباعية (TTX) على الثقافة بتركيز 1 ميكرومتر ، لمنع قنوات الصوديوم ذات الجهد الكهربائي والتسجيل لمدة دقيقتين. استخدم هذا لإجراء اكتشاف السنبلة (2.1 و 2.2).

2. تحليل البيانات

1. باستخدام البرنامج المناسب ، اكتشف النشاط التلقائي لكل قطب كهربائي باستخدام كاشف يعتمد على الانحرافات المعيارية ومميز لاحق. يظهر النشاط على شكل عابرات جهد سريع (<5 مللي ثانية).
2. اختر حدا لا ينتج عنه أي نشاط عند تحليل العينات المعالجة ب TTX. قم بتكييف قيمة العتبة لكل تجربة للتمييز بين الاكتشافات الإيجابية الخاطئة والسلبية الخاطئة.
3. باستخدام البرنامج المناسب ، راقب النشاط العصبي المكتشف لكل قطب كهربائي كمخطط نقطي وفقا للإجراءات القياسية (انظر الشكل 1A-C).
4. تحديد وعرض إجمالي نشاط الشبكة عن طريق تلخيص جميع الأحداث المكتشفة داخل نافذة منزلقة مدتها 10 مللي ثانية، مع إزاحتها بمقدار 1 مللي ثانية.
5. اكتشف النشاط الناجم عن التحفيز من خلال عرض البيانات الأولية باستخدام برنامج التحليل المناسب. تحديد المسامير الفردية في وضع عدم الاتصال يدويا. تظهر المسامير المفردة كعابرات جهد سريعة ، تحدث بعد قطعة التحفيز (رأس السهم في الشكل 1E). يظهر مثال في الشكل 1E.
6. اعتمادا على التجربة ، قم بتحليل عدد الأقطاب الكهربائية المستجيبة ، والعتبة اللازمة لتحقيق الاستجابة ، وعدد إمكانات الفعل لكل أقطاب كهربائية وغيرها من المعلمات ذات الأهمية.

النتائج

الشكل 1. تسجيلات البيانات في منطقة الشرق الأوسط وأفريقيا. (أ) آثار التسجيلات الأصلية لستة من أصل 63 قطبا كهربائيا تظهر نشاطا تلقائيا. (ب) مخطط نقطي للأقطاب الكهربائية الستة في الشكل 1 أ بعد اكتشاف السنبل. يمثل كل شريط إمكانات عمل واحدة. (ج) مخطط نقطي بما في ذلك جميع الأقطاب الكهربائية (كما هو الحال في A و B

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات محلول خارج الخلية (درجة الحموضة 7.4) كلوريد الصوديوم 145 ملي كيه سي إل 4 مللي مغنكلوريد₂ 1 ملي متر كلوريد_{الهواء 2} 2 مللي هيبس 5 مللي متر Na-pyruvate 2 مللي الجلوكوز 5 مللي متر المواد أقطاب MEA قواني للعلوم البيولوجية (لوزان، سويسرا) برمجيات لابوفيو الصكوك الوطنية سويسرا إيجوربرو مقاييس الموجة بحيرة أوسويغا ، الولايات المتحدة الأمريكية