تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
ملاحظة: يجب أن يكون كل مشارك مشارك في الإجراء مدربا بشكل صحيح على الإجراءات الجراحية الأساسية ويجب أن يكون لديه ترخيص ساري المفعول لإجراء التجارب على.
< p class = "jove_title" >
1. التخدير والتطبيب المسبق
- تخدير الفئران بالحقن داخل الصفاق من البنتوباربيتال الصوديوم (جرعة أولية قدرها 60 ملغم·كغ-1 لذكور فئران الويستار البالغة من العمر 6 أشهر والتي تزن 400-550 جم).
ملاحظه: لا يقتصر هذا البروتوكول على السلالة أو الجنس أو العمر المشار إليه للفئران. أيضا ، يمكن استخدام التخدير البديل ، مثل مزيج الكيتامين والزيلازين ، أو ألفا كلورالوز ، أو الفنتانيل + ميدازولام + ميديتوميدين ، إذا كان أكثر ملاءمة لأهداف البحث المختلفة أو عند الحاجة من قبل لجنة الأخلاقيات.
- بعد حوالي 5 دقائق ، تحقق من عمق التخدير عن طريق الضغط على إصبع الطرف الخلفي للفأر بملقط حاد. تابع الخطوات التالية للبروتوكول فقط في حالة عدم ملاحظة أي إجراء انعكاسي.
- حقن 0.05 مل من الأتروبين تحت الجلد من أجل تقليل إنتاج المخاط بعد التنبيب.
- حقن تحت الجلد 5 مل من محلول الفوسفات الذي يحتوي على محلول جلوكوز 4٪ و NaHCO3 (1٪) والجيلاتين (14٪). سيتم امتصاص هذا المخزن المؤقت بواسطة الأوعية الجلدية طوال التجربة وسيساعد في الحفاظ على توازن السوائل.
- خلال الجراحة ، قم بفحص بشكل دوري بحثا عن الإجراءات الانعكاسية واستكمل التخدير إذا لزم الأمر (10 مجم كجم -1 ساعة -1 من بنتوباربيتال الصوديوم).
< p class = "jove_title" >
2. الجراحة
- جهز للعلاج الجراحي عن طريق حلق الفراء على الجزء الظهري من الطرف الخلفي الأيسر ، من الكاحل إلى الورك ، والجانب الخلفي ، ومن الذيل إلى الأجزاء الصدرية العالية (Th) ، والجانب الأيسر من الصدر ، والجانب البطني من منطقة الرقبة فوق القص
- وضع الخط الوريدي
- ضع الجرذ على ظهره على وسادة تسخين مغلقة الحلقة (وقم بتثبيته بتثبيتات الأطراف).
- باستخدام شفرة 21 ، قم بعمل قطع طولي عبر الجلد من القص إلى الذقن.
- امسك الجلد بالملقط وافصله عن الأنسجة الأساسية.
- باستخدام تقنيات التشريح الحادة ، قم بكشف الوريد الوداجي الأيمن. قم بتشريح الوريد بعناية من الأنسجة المحيطة.
- حدد موقع جزء الوريد بدون نقاط متفرعة وانزلق اثنين من الأربطة 4-0 تحته.
- اصنع عقدة فضفاضة واحدة على الطرف القريب من الجزء غير المتفرع المحدد مسبقا من الوريد وعقدة فضفاضة واحدة على الطرف البعيد من هذا الجزء من الوريد. قم بتثبيت الوريد القريب من القلب ، ثم اربط الجزء البعيد من الوريد.
- باستخدام مقص القزحية ، قم بعمل شق بين المشبك والأربطة البعيدة. أمسك رفرف من الوريد وأدخل قسطرة مملوءة مسبقا إلى النقطة التي يتم فيها حظرها بواسطة المشبك.
- أثناء إمساك الوريد والقسطرة مع الملقط ، قم بإزالة المشبك وادفع القسطرة عدة ملليمترات في الوريد. ثبت طرفي القسطرة في الوريد وإضافة نقطة تثبيت إضافية إلى الجلد.
< p class = "jove_title" >
3. مقدمة من أنبوب القصبة الهوائية
- باستخدام ملقط حاد ، افصل بين الغدد السفلية التي تغطي عضلات القص اللامية. افصل عضلات القص الوهمية عند خط الوسط لكشف القصبة الهوائية.
- انزلق ثلاث أربطة 4-0 أسفل القصبة الهوائية ، ثم قم بعمل عقدتين أسفل نقطة إدخال أنبوب القصبة الهوائية وعقدة واحدة أعلاه.
- حدد موقع الغضروف الحلقي للحنجرة وقم بعمل شق أسفل الغضروف الرغامي الثالث.
- أدخل أنبوب القصبة الهوائية أسفل القصبة الهوائية وقم بتثبيت الأنبوب في مكانه باستخدام أربطة معدة مسبقا ، ثم أضف رباط إضافي إلى الجلد.
- ضع قطعة صغيرة من الصوف القطني فوق العضلات المنفصلة وخياطة الجلد فوق المنطقة التي تم تشغيلها.
< p class = "jove_title" >
4. تشريح أعصاب الأطراف الخلفية
- باستخدام شفرة 21 ، قم بعمل قطع طولي على الجانب الخلفي من الطرف الخلفي الأيسر ، من وتر العرقوب إلى الورك.
- امسك الجلد بالملقط ، وباستخدام تقنيات التشريح الحادة ، افصل الجلد عن العضلات الأساسية على جانبي الشق.
- حدد موقع الحفرة المأبضية في الجزء الخلفي من مفصل الركبة ، والتي تغطيها العضلة ذات الرأسين الفخذية ، وباستخدام المقص ، قم بعمل قطع بين الجزء الأمامي والخلفي من هذه العضلة.
- التحرك لأعلى ، قم بقطع رأسين من العضلة ذات الرأسين الفخذية وصولا إلى الورك لفضح العصب الوركي. الكي حسب الحاجة لمنع النزيف.
- تحديد الفروع الشظوية السورالية والظنبوبية والشائعة للعصب الوركي.
- باستخدام المقص ، افصل الرأس الجانبي عن الرأس الإنسي لعضلة المعدة لفضح العصب الظنبوبي وفروعه.
- باستخدام 55 ملقطا ، أمسك الطرف البعيد للعصب السورالي ، واقطعه بعيدا ، وقم بتشريحه قدر الإمكان.
- كرر الإجراء مع العصب الشظوي المشترك.
- باستخدام قضيب زجاجي غير حاد ، افصل العصب الظنبوبي عن الأنسجة المحيطة ، مع الحرص على عدم إتلاف الأوعية الدموية ، وقطعه بعيدا.
- التعرف على أعصاب المعدة الإنسي (MG) والأعصاب الجانبية المعدية والنعل (LGS).
- باستخدام 55 ملقطا ، قم بتشريح أعصاب MG و LGS بعناية ، وفصلها عن الأنسجة المحيطة مع الحفاظ على اتصالها بالعضلات المعنية.
- ضع قطعة من الصوف القطني المبللة بالمحلول الملحي تحت الأعصاب المكشوفة.
- أغلق الجلد فوق المنطقة التي يتم تشغيلها.
5. استئصال الصفيحة الفقرية
- باستخدام شفرة 21 ، قم بعمل شق طولي من العجز حتى الفقرات
الصدرية
- افصل الجلد عن العضلات الأساسية.
- قطع العضلة الطويلة على جانبي العمليات الشائكة الصدرية والقطنية.
- باستخدام مشرط ذو حواف حادة ، اسحب العضلات من العمود الفقري لفضح العمليات العرضية لكل فقرة.
- باستخدام مقص طرف غير حاد ، قم بقطع أوتار العضلات المتصلة بالعمليات العرضية على طول العمود الفقري المكشوف. ضع عوامل مرقئ إذا لزم الأمر.
- حدد فقرة Th13 على أنها الجزء الصدري السفلي مع إدخال الضلع ، وباستخدام الرونجور الدقيقة ، قم بإزالة العمليات الشائكة والصفيحة من الفقرات Th13 إلى L2 لكشف الأجزاء القطنية من الحبل الشوكي. تذكر عدم إتلاف العملية الشائكة L3 ، والتي سيتم استخدامها كنقطة تثبيت لتثبيت العمود الفقري.
- قم بإزالة العملية الشائكة Th12 وتنعيم السطح الظهري للفقرات قدر الإمكان.
- باستخدام تقنيات التشريح الحادة ، افصل العضلات عن فقرة Th11 لإنشاء نقاط إدخال الحامل.
- ضع الصوف القطني الرقيق المنقوع بالمحلول الملحي فوق أجزاء الحبل الشوكي المكشوفة.
- انقل الجرذ إلى الإطار المعدني المصنوع خصيصا مع شريطين متوازيين وذراعين قابلين للتعديل مع مشابك لدعم العمود الفقري وتثبيته.
< p class = "jove_title" >
6. التحضير للتسجيل والتحفيز
- تثبيت العمود الفقري وترتيب الأعصاب
- ضع الجرذ في الإطار المخصص على وسادة تسخين متصلة بنظام التسخين ذو الحلقة المغلقة للحفاظ على درجة حرارة جسم عند 37 ± 1 درجة مئوية.
- أدخل أقطاب كهربائية لمخطط كهربية القلب (ECG) تحت الجلد وقم بتوصيلها بمكبر للصوت لمراقبة معدل ضربات القلب.
- باستخدام اللوحات الجلدية ، قم بتشكيل بركة عميقة فوق الحبل الشوكي المكشوف.
- باستخدام المشابك المعدنية ، قم بإصلاح العمود الفقري عن طريق وضع المشابك أسفل العمليات المستعرضة Th12 وفي عملية L3 الشائكة.
- تأكد من تأمين العمود الفقري وترتيبه أفقيا ، ثم قم بالضغط الظهري البطني على جانبي العمود لسحب العضلات.
- املأ المسبح بالزيت المعدني الدافئ (37 درجة مئوية) وحافظ عليه عند درجة الحرارة هذه.
- قم بربط 4-0 من خلال وتر العرقوب ، ورفع وتمديد الطرف الخلفي الأيسر الذي تم تشغيله بحيث يتم تسوية الكاحل مع الورك.
- باستخدام اللوحات الجلدية ، قم بعمل بركة عميقة فوق أعصاب الظنبوب و MG و LGS المكشوفة.
- املأ المسبح بالزيت المعدني الدافئ (37 درجة مئوية).
- ضع أعصاب MG و LGS على أقطاب كهربائية محفزة ثنائية القطب من الأسلاك الفضية وقم بتوصيلها بمحفز نبض مربع. استخدم قنوات تحفيز منفصلة لكل عصب.
< p class = "jove_title" >
7. وضع القطب السطحي
- ضع قطبا كهربائيا كرويا فضيا على الجانب الذيلي الأيسر من الحبل الشوكي المكشوف ، مع إدخال قطب مرجعي في عضلات الظهر ، وقم بتوصيل كلا القطبين بمكبر التيار المستمر التفاضلي. سيتم استخدام القطب الكروي السطحي لتسجيل الوابل الوارد من الأعصاب.
- باستخدام محفز تيار مستمر ، قم بتحفيز أعصاب MG و LGS بنبضات مربعة مدتها 0.1 مللي ثانية ، تتكرر بتردد 3 هرتز ، ولاحظ الوابل الوارد.
- حدد العتبة (T) لتنشيط الأعصاب ، وتحفيز كل عصب بكثافة 3 · T تقريبا ، وسجل سعة الكرة الواعدة لكل عصب.
- حرك القطب السطحي المنقاري وكرر الإجراء لتحديد أجزاء العمود الفقري التي تكون فيها اتساع الكرات الهوائية هي الأعلى لكل عصب. بعد تحديد الحد الأقصى لموقع الكرة الهوائية ، حرك القطب السطحي إلى مسافة آمنة من الحبل الشوكي.
- شلل عضلي وتشكيل استرواح الصدر لتقليل حركات الجهاز التنفسي
شل - الجرذ عن طريق الوريد باستخدام مانع عصبي عضلي وتوصيل أنبوب القصبة الهوائية بجهاز تهوية خارجي بما يتماشى مع مقياس الكابنويد المتوافق مع القوارض (بروميد البانكورونيوم ، بجرعة أولية قدرها 0.4 مجم كجم -1 ، يتم استكماله كل 30 دقيقة بجرعات 0.2 مجم كجم-1)
- راقب تركيز ثاني أكسيد الكربونفي نهاية المد والجزر وحافظ عليه عند حوالي 3-20124٪ عن طريق ضبط معلمات التهوية (التردد وضغط الهواء وأحجام التدفق).
- قم بعمل شق طولي في الجلد بين الضلع 5 و 6 على جانب التسجيل.
- باستخدام مقص طرف حاد ، قم بقص العضلات العلوية لتصور المسافة الوربية بين الأضلاع.
- باستخدام مقص صغير حاد ، قم بعمل شق صغير في العضلات الوربية وفي غشاء الجنب ، ثم أدخل طرف ملقط حاد الحافة في الفتحة ، مع الحرص على عدم الضغط على الرئتين.
- اسمح للملقط بالتمدد أو إدخال أنبوب صغير لإبقاء استرواح الصدر مفتوحا طوال التجربة.
- بعد الإحصار العصبي العضلي ، راقب عمق التخدير عن طريق فحص تردد تخطيط القلب واستكمال عامل التخدير إذا تجاوز معدل ضربات القلب 400 نبضة في الدقيقة. شلل عضلي وتشكيل استرواح الصدر لتقليل حركات الجهاز التنفسي مما يحسن استقرار التسجيل.
< p class = "jove_title" >
8. فتح الأم الجافية والبيا
- باستخدام ملقط # 55 ، ارفع الأم الجافية برفق واقطعها بشكل ذيلي من الجزء L5 ، حتى الجزء L4.
- باستخدام زوج من ملقط 5SF الرقيق للغاية ، قم بعمل رقعة صغيرة في pia تغطي العمود الظهري بين الأوعية الدموية ، تماما على مستوى أقصى تسديدة واردة من MG أو عصب LGS.
- استخدم قطعا صغيرة من رغوة الجل المنقوعة بالمحلول الملحي والمجففة لمنع النزيف إذا لزم الأمر.
< p class = "jove_title" >
9. وضع قطب التحفيز التياري المباشر عبر العمود الفقري (tsDCS)
- قم بعمل شق صغير في الجلد على الجانب البطني من بطن الفئران على مستوى الجذر الذهبي المقابل لموقع أجزاء العمود الفقري القطنية (L) 4-L5.
- أمسك رفرف الجلد المكشوف بمشبك معدني ، والذي سيكون بمثابة قطب مرجعي.
- ضع إسفنجة مبللة بالمحلول الملحي على الجانب الظهري للفقرة الصدرية (Th) 12. تأكد من أن حجم الإسفنج يساوي حجم قطب TSDCS النشط (صفيحة فولاذية مقاومة للصدأ على شكل دائرة قطرها 5 مم).
- باستخدام مناور دقيق ، اضغط على الإسفنجة بقطب كهربائي نشط tsDCS على العظم وتأكد من الضغط على سطح القطب بالكامل بالتساوي.
- قم بتوصيل أقطاب tsDCS المرجعية والنشطة بوحدة محفز تيار مستمر قادرة على توفير تدفق مستمر للتيار المباشر.
< p class = "jove_title" >
10. تحضير الماصات الدقيقة
- باستخدام مجتذب قطب كهربائي دقيق ، قم بإعداد قطب كهربائي صغير.
ملاحظه: يمكن استخدام كل من الأقطاب الكهربائية الخيوط وغير الخيطية. ومع ذلك ، تذكر أن ساق القطب يجب أن يكون طويلا بما يكفي للوصول إلى القرن البطني بينما يكون رقيقا بما يكفي لعدم ضغط الحبل الشوكي أثناء النزول.
- اضبط إعداد الساحب بحيث يبلغ طول الساق التي تدخل الحبل الشوكي حوالي 3 مم ، بينما لا يزيد قطر طرف القطب عن 1 ميكرومتر ، ومقاومة الأقطاب الكهربائية الدقيقة بين 10 و 20 MΩ.
- املأ الأقطاب الكهربائية الدقيقة بالكهرباء 2M سترات البوتاسيوم.
- قم بتركيب القطب الصغير المحضر على المعالج الدقيق ، مما يسمح بحركة متدرجة 1 - ميكرومتر ومعايرة التجسيم.
- قم بتوصيل القطب الصغير بمكبر الصوت داخل الخلايا باستخدام القطب المرجعي الموجود في عضلات الظهر.
- بعد الإحصار العصبي العضلي ، راقب عمق التخدير عن طريق فحص تردد مخطط كهربية القلب (ECG) واستكمل عامل التخدير بحيث لا يتجاوز معدل ضربات قلب الفئران 400 نبضة في الدقيقة.
فئة
11. تتبع الخلايا العصبية الحركية واختراقها
- ضع قطب تسجيل الكرة الهوائية الواردة مرة أخرى على السطح الظهري للحبل الشوكي ، بشكل ذيلي إلى موقع موقع التسجيل ، على مستوى الجزء L6.
- تحفيز أعصاب المعدة الإنسي (MG) والأعصاب الجانبية المعدية والنعل (LGS) بنبضات كهربائية تبلغ 0.1 مللي ثانية بتردد 3 هرتز وشدة 3 طن لتنشيط جميع محاور الخلايا العصبية الحركية ألفا داخل عصب محدد.
- قم بدفع الماصة الدقيقة إلى رقعة محددة في pia بزاوية متوسطة جانبية تبلغ 15-20 درجة (مع طرف موجه بشكل جانبي).
- بعد النزول تحت السطح ، قم بمعايرة القطب الصغير وتعويض سعته وإزاحة الجهد ، واستمر في اختراق الحبل الشوكي عندما تكون جميع المعلمات مستقرة. سيكون جهد المجال المضاد لتجمع الخلايا العصبية الحركية مرئيا عند تتبع جهد القطب الكهربائي الدقيق أثناء الاقتراب من نواة حركية مخصصة أثناء تحفيز العصب المعني.
- استمر في الاختراق باستخدام القطب الصغير بخطوات 1-1 ميكرومتر واستخدم بشكل دوري وظيفة الطنين لمضخم الصوت داخل الخلايا لمسح طرف القطب من أي بقايا.
- لاحظ اختراق الخلايا العصبية الحركية ، والذي سيتميز بفرط استقطاب مفاجئ لتتبع الجهد المسجل وظهور إمكانات ارتفاع مضاد.
فئة
12. تسجيل غشاء الخلايا العصبية الحركية وخصائص إطلاق
النار
- في وضع الجسر لمضخم الصوت داخل الخلايا ، حدد الخلايا العصبية الحركية بناء على مظهر "كل شيء أو لا شيء" لجهد العمل المضاد عن طريق تحفيز الفروع العصبية المعنية. سجل 20 تتبعا لاحقا لحساب المتوسط لاحقا.
- تنفيذ معيار إدراج صارم لضمان بيانات عالية الجودة: إمكانات الغشاء المريح التي لا تقل عن -50 مللي فولت في السعة ؛ اتساع جهد الفعل أكبر من 50 مللي فولت ، مع تجاوز إيجابي ؛ استقرار إمكانات الغشاء لمدة 5 دقائق على الأقل قبل التسجيل.
- في وضع المشبك الحالي المتقطع (وضع معدل التبديل الحالي 4-8 كيلو هرتز) لمضخم الصوت داخل الخلايا ، استحضر جهد عمل تقويمي في الخلايا العصبية الحركية باستخدام نبضات تيار إزالة الاستقطاب داخل الخلايا 0.5 مللي ثانية. كرر 20 مرة على الأقل لحساب المتوسط في وضع عدم الاتصال.
- تحفيز الخلايا العصبية الحركية ب 40 نبضة قصيرة (100 مللي ثانية) من تيار فرط الاستقطاب (1 نانو أمبير) من أجل حساب مقاومة إدخال الخلية.
- تحفيز الخلايا العصبية الحركية بنبضات الموجة المربعة 50 مللي ثانية عند السعات المتزايدة لتحديد قيمة القاعد الريوي كحد أدنى لسعة تيار إزالة الاستقطاب المطلوب لاستنباط ارتفاع واحد.
- حقن نبضات موجة مربعة تبلغ 500 مللي ثانية من تيار إزالة الاستقطاب ، بسعة متزايدة بخطوات من 0.1 إلى 2 نانو أمبير لاستحضار التصريفات الإيقاعية للخلايا العصبية الحركية.
فئة
13. تحفيز التيار المباشر عبر العمود الفقري (tsDCS)
- مع الحفاظ على اختراق مستقر للخلايا العصبية الحركية ، ابدأ إجراء الاستقطاب عن طريق تطبيق التيار المباشر عبر العمود الفقري. اضبط الكثافة الحالية ووقت التطبيق وفقا لتصميم التجربة (على سبيل المثال ، 0.1 مللي أمبير لمدة 15 دقيقة).
- مباشرة بعد تشغيل التيار المستمر ، لاحظ إمكانات غشاء الخلايا العصبية الحركية. يجب أن يؤدي الاستقطاب الأنودي (القطب النشط كأنود) إلى إزالة استقطاب إمكانات الغشاء ، في حين أن الاستقطاب الكاثودي (القطب النشط ككاثود) يجب أن يثير تأثيرا معاكسا. لاحظ ما إذا كان التغيير في إمكانات غشاء الراحة استجابة لتحفيز التيار المستمر ثابتا ، مما يضمن عدم تأثر شدة المجال الكهربائي.
- أثناء تطبيق التيار المستمر ، كرر الخطوات 5.3-6 على فترات 5 دقائق.
- قم بإيقاف تشغيل DC واستمر في تكرار الخطوات 5.3-6 على فترات مدتها 5 دقائق حتى تصبح التسجيلات غير مستقرة أو يتم اختراق معايير الإدراج.
- إنهاء التجربة والقتل الرحيم للحيوان باستخدام إعطاء جرعة قاتلة من البنتوباربيتال الصوديوم عن طريق الوريد (180 مجم كغ-1).