تطبيق تيارات الضوضاء على الخلايا العصبية للنواة الدهليزية الإنسية باستخدام تقنية مشبك التصحيح للخلية الكاملة

الملخص

المصدر: Stefani ، S. P. ، وآخرون. تطبيق الضوضاء العشوائية لتقييم حساسية الخلايا العصبية للنواة الدهليزية الإنسية في المختبر. J. Vis. Exp. (2019).

يوضح هذا الفيديو بروتوكولا يتضمن تطبيق تيارات ضوضاء تحت العتبة على الخلايا العصبية للنواة الدهليزية الإنسية باستخدام تقنية مشبك التصحيح للخلية الكاملة لدراسة تأثير تيارات الضوضاء على حساسية الخلايا العصبية للمنبهات الكهربائية.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

< p class = "jove_title" >1.

< p class = "jove_content" >ملاحظة: تم الحصول على الفئران من مركز القوارض الأسترالي (ARC; بيرث ، أستراليا) وعقدت في منشأة بناء التابعة للمؤسسة الطبية بجامعة سيدني.

1. حافظ على الفئران في دورة إضاءة / ظلام قياسية مدتها 12 ساعة مع إثراء البيئة.
2. استخدم ذكور وإناث الفئران C57BL / 6 (3-5 أسابيع) لجميع التجارب.

< p class = "jove_title" >2. إعداد الحلول

1. تحضير 1 لتر من السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي (ACSF) يتكون من 29 ملي مولار من NaHCO₃ ، 11 ملي جلوكوز ، 120 ملي كلوريد الصوديوم ، 3.3 ملي كلوريد كلوريد ، 1.4 ملي هيدروهيدروكسيد_{هيدروكسيد 2}PO₄ ، 2.2 ملي ملي كلوريد_{الملجم 2} ، 2.77 ملي كلوريد_{النحاسيوم 2}.
2. تحضير 200 مل من السكروز-ACSF (sACSF) تحتوي على 29 ملي مولار من NaHCO₃ ، 11 ملي مولار جلوكوز ، 241.5 ملي سكروز ، 3.3 ملي كلوريد كلوريد ، 1.4 ملي هيدروهيدرات_{هيدروكسيد 2}PO₄ ، 2.2 ملي ملي كلوريد_{المغنيد 2} ، 2.77 ملي كلوريد_{الكالسيوم 2}. قبل إضافة CaCl₂ إلى ACSF و sACSF ، قم بغاز المحاليل بالكربوجين (95٪ O₂ و 5٪ CO₂) لإنشاء درجة حموضة 7.4 وتجنب ترسيب الكالسيوم (الغيوم).
3. تحضير محلول داخل الخلايا قائم على K ⁺ يتكون من 70 ملي مولار غلوكونات البوتاسيوم ، 70 ملي مولار كلوريد الصوديوم ، 2 ملي كلوريد الصوديوم ، 10 ملي هيبس ، 4 ملي EGTA ، 4 ملي ملي ملغ_2-ATP ، 0.3 ملي مولار Na_3-GTP ، مع درجة حموضة نهائية 7.3 (معدلة باستخدام KOH).
   ملاحظه: يوصى بتصفية المحاليل داخل الخلايا بمرشحات 0.22 ميكرومتر وتخزينها في حصص 0.5 مل عند -20 درجة مئوية.

< p class = "jove_title" >3. تحضير جذع الدماغ

1. قبل استخراج جذع الدماغ ، قم بموازنة sACSF مع الكربوجين وتبرد عند -80 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة لتشكيل ملاط ثلج.
2. تخدير الفأر بالأيزوفلوران (3-5٪) المشبع بالأكسجين (3 مل / دقيقة). بمجرد غياب ردود الفعل الخلفية ، اقطع رأس الماوس بمقص حاد من الفولاذ المقاوم للصدأ.
3. كشف الجمجمة عن طريق عمل شق سهمي في الجلد باستخدام شفرة حلاقة (# 22 مدورة).
4. باستخدام الطرف المدبب لزوج من مقص النمط القياسي ، قم بعمل شق صغير في لامدا وقم بقصه على طول الشق الطولي.
5. عكس بعناية العظام الجدارية والقذالية المزدوجة باستخدام زوج من Pearson rongeurs الضحلة ذات الانحناء.
   ملاحظه: يتم استحمام الدماغ باستمرار في الموقع باستخدام ملاط sACSF المثلج المعد مسبقا أثناء هذا الإجراء.
6. اعزل جذع الدماغ عن الدماغ الأمامي وغلافه العظمي باستخدام شفرة حلاقة (# 11 مستقيمة) لقطع التلم الجداري القذالي وفي النخاع الذيلي.
7. قم بتركيب الطرف البطني المعزول لجذع الدماغ على كتلة البوليسترين شبه المنحرفة المقطوعة مسبقا. استخدم فتيلا من المناديل الورقية لإزالة السوائل الزائدة حول الأنسجة المقطوعة وضمان التصاق الأنسجة بشكل جيد بمرحلة القطع.
   ملاحظه: يتم قطع كتلة البوليسترين في شكل شبه منحرف لضمان ملاءمة الطرف المنقاري للدماغ المتوسط وتناقص تدريجي في الحبل الشوكي.
8. استخدم غراء السيانواكريليت لإصلاح كتلة البوليسترين بالطرف المنقاري المرفق لجذع الدماغ وصولا إلى مرحلة القطع.
9. باستخدام سرعة متقدمة تبلغ 0.16 مم / ثانية وسعة اهتزاز 3.00 مم ، قم بإعداد شرائح عرضية 200 ميكرومتر من MVN.
   ملاحظه: يتم تحديد موقع MVN باستخدام أطلس دماغ الفأر Paxinos و Franklin. يقع MVN (المدرج باسم MVe في الأطلس) على الفور في البطين الرابع وهو الأكبر قبل ربط المخيخ (بين القولون السفلي والوظيفة).
10. استخدم ماصة مشذبة بالبلاستيك لنقل الشرائح إلى قرص ورق ترشيح موجود في ACSF مكربن عند 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل التسجيل.

< p class = "jove_title" >4. الأدوات

1. استخدم إعدادا فيزيولوجيا كهربيا قياسيا لأداء تقنية مشبك التصحيح للخلية بأكملها.
2. قم بإعداد الماصات الدقيقة باستخدام بروتوكول من خطوتين (درجة الحرارة 1: 70؛ درجة الحرارة 2: 45) على مجتذب ماصات دقيقة (انظر جدول المواد).
3. عند وضعها في الحمام، يجب أن تتمتع الماصات الدقيقة بمقاومة نهائية تتراوح من 3 إلى 5 MΩ بمحلول داخلي.
   ملاحظه: قد تختلف الإعدادات المستخدمة حسب درجة الحرارة داخل الغرفة ويمكن أن تتغير بشكل متكرر.

فئة

5. الفيزيولوجيا الكهربية لمشبك التصحيح للخلية

الكاملة

1. للحصول على تسجيلات مشبك التصحيح للخلية الكاملة من الخلايا العصبية الفردية في MVN ، يتم استخدام محلول داخلي قائم على K + داخل ماصة التسجيل.
2. انقل شريحة من الأنسجة من غرفة الحضانة إلى غرفة التسجيل وثبتها باستخدام خيط نايلون على شكل حرف U. قم ببث غرفة التسجيل باستمرار باستخدام ACSF المكربوجين عند 25 درجة مئوية بمعدل تدفق 3 مل / دقيقة.
3. بعد ملء الماصة الدقيقة بمحلول داخلي، حدد موقع MVN باستخدام عدسة موضوعية منخفضة الطاقة (10x). باستخدام هدف عالي الطاقة (40x) ، يمكن تحديد موقع الخلايا العصبية الفردية داخل MVN.
   ملاحظه: تعد جودة الخلية ضرورية لضمان جودة التسجيلات ومتانة الخلية عند محاولة تحقيق تكوين الخلية بأكملها. ستظهر الخلية المناسبة شكلا كرويا وغشاء خلية عاكس ونواة غير مرئية. سيكون للخلية غير المناسبة نواة مرئية كبيرة (تشبه البيضة) ومظهر منتفخ / منكمش.
4. قبل اختراق الأنسجة باستخدام الماصة، استخدم قدرا صغيرا من الضغط الإيجابي لدفع الحطام بعيدا عن طرف الماصة.
5. حرك الماصة باستخدام الملاعب الدقيقة باتجاه الخلية العصبية المختارة ، ويجب أن تتشكل غمازة صغيرة على الغشاء العصبي.
   حرر الضغط الإيجابي وقم بتطبيق كمية صغيرة من الضغط السلبي.
6. بمجرد الحصول على مانع تسرب 1 GΩ، قم بتطبيق ضغط سلبي لطيف وقصير وحاد على حامل الماصة من خلال منفذ الشفط لتمزيق الغشاء وإنشاء تكوين خلية كاملة.
7. قم بعمل تسجيلات المشبك الحالية للخلية الكاملة باستخدام التقنيات القياسية.

< p class = "jove_title" >6. تطبيق الضوضاء الجيبية والستوكاستيك على الخلايا العصبية الفردية للنواة الدهليزية الإنسية

1. تطبيق الضوضاء العشوائية والجيبية في نطاق من السعات من 3 إلى 24 pA لتحديد عتبة الخلايا العصبية ومعدل إطلاق النار.
2. حدد العتبة الحسية عن طريق تجميع شدة التحفيز المنخفضة والعالية وإجراء ANOVA لملاحظة أي اختلافات (كما هو موضح في الشكل 1).
3. احسب متوسط معدل إطلاق النار خلال فترة 10 ثوان حيث تم / سيتم حقن الخطوة الحالية لإزالة الاستقطاب لكل مستوى تيار فردي (أي إجمالي 7 حلقات ؛ الشكل 2).
4. استخدم متوسط قيم معدل إطلاق النار لإنشاء معدل إطلاق مقابل المخطط الحالي وإجراء تحليل انحدار خطي لتحديد تدرج الخط الأنسب. يشير تدرج الخط الأنسب إلى اكتساب الخلايا العصبية.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: التحديد الموضوعي لعتبة 12 باسكال تم تجميع معدلات إطلاق النار لأقل من 12 باسكال (3 و 6 باسباسكال) وأكثر من 12 باسكال (18 و 24 باسكالتر) ومتوسطها. ثم تم تحليل هذه المتوسطات باستخدام ANOVA والدلالة الإحصائية بين shom و >12 pA وبين <12 pA و >12 pA. * ص < 0.05.

< p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات كلوريد_{الهواء 2} شارلاو CA01951000 تستخدم ل ACSF و sACSF د- (+) - جلوكوز سيغما G8270 تستخدم ل ACSF و sACSF EGTA سيغما E0396-25G تستخدم للحل داخل الخلايا القائم على K هيبس سيغما H3375-25G تستخدم للحل داخل الخلايا القائم على K كيه سي إل الإمداد الكيميائي PA054-500 جرام تستخدم ل ACSF و sACSF والمحلول داخل الخلايا ك-غلوكونات سيغما P1847-100G تستخدم للحل داخل الخلايا القائم على K مجم - ATP سيغما أ 9187-500 ملغ تستخدم للحل داخل الخلايا القائم على K إم جي كلوريد الإمداد الكيميائي MA00360500 تستخدم ل ACSF و sACSF نا_3-GTP سيغما G8877-100 ملغ تستخدم للحل داخل الخلايا القائم على K كلوريد الصوديوم الإمداد الكيميائي SO02270500 استخدم ل ACSF والمحلول داخل الخلايا NaH₂PO 4.2H ₂O اياكس AJA471-500G تستخدم ل ACSF و sACSF NaHCO₃ سيغما S5761-1 كجم تستخدم ل ACSF و sACSF سكروز الإمداد الكيميائي SA030-500G تستخدم ل sACSF إيزوفلوران هنري شاين 1169567762 يستخدم لتخدير الفئران معدات الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات أدوات وارنر GC150T-7.5 1.5 مم OD ، معرف 1.16 مم ، 7.5 سم < br / > طول برنامج الحصول على البيانات أكسوغراف تستخدم للفيزيولوجيا الكهربية والتحليل فريدمن بيرسون رونجورز أدوات الدقة العالمية 14089 تستخدم للتشريح مجتذب الماصات الدقيقة ناريشيجي ص - 830 تستخدم للماصة الدقيقة مكبر للصوت متعدد المشبك أدوات المحور العصبي 700 ب تستخدم في الفيزيولوجيا الكهربية مقياس الأس الهيدروجيني سبر علمية 860033 تستخدم للحل الداخلي مقص النمط القياسي FST 14028-10 تستخدم للتشريح مناور دقيق Sutter سوتر MP-225/م تستخدم في الفيزيولوجيا الكهربية مجهر عمودي أوليمبوس BX51WI تستخدم في الفيزيولوجيا الكهربية الاهتزاز لايكا VT1200 تستخدم لتقطيع أنسجة المخ