الكشف عن مستويات بيروكسيد الهيدروجين في الخلايا العصبية المستنبتة من خلال التصوير الفلوري للخلايا الحية

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Terzi ، A. et al. ، ROS تصوير الخلايا الحية أثناء تطور الخلايا العصبية.J. Vis. Exp. (2021).

يوضح هذا الفيديو تقنية للكشف عن مستويات بيروكسيد الهيدروجين في الوقت الفعلي في الخلايا العقدية الشبكية باستخدام المستشعر الحيوي roGFP2-Orp1 وتقنيات تصوير الخلايا الحية. يحدد الخطوات المتبعة في تحضير الخلية ، والتصوير الفلوري ، والتقدير الكمي لمستويات بيروكسيد الهيدروجين.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تصوير أنواع الأكسجين التفاعلي في المختبر (ROS) للخلايا العصبية المستنبتة للخلايا العقدية الشبكية (RGC)

1. في يوم التصوير (عادة بعد 6-24 ساعة من طلاء الخلايا) ، افحص خلايا العقدة الشبكية تحت المجهر للتحقق من نمو محاور RGC.
2. لتصوير الخلايا الحية، انقل الغطاء من طبق المزرعة إلى غرفة تصوير الخلايا الحية.
3. قم بإعداد المجهر للتصوير. استخدم مجهرا مقلوبا مزودا بهدف تباين التداخل التفاضلي (DIC) ، ومرشح أحمر طويل التمرير OG590 ، وكاميرا EM-CCD.
4. قبل التصوير ، يتم استبدال وسط استزراع خلايا الزرد بالمصل والمضادات الحيوية (ZFCM) (+)) بوسط زراعة خلايا الزرد بدون مصل ومضادات حيوية (ZFCM (-)).
5. بمجرد وضع الخلايا بهدف 10x ، احصل على صور بتكبير 60x باستخدام هدف غمر زيت NA مرتفع. استخدم تكبيرا إضافيا بمقدار 1.5x.
6. أولا ، احصل على صور DIC. بعد ذلك ، قم بتصوير roGFP2-Orp1 باستخدام مجموعة مرشحات مناسبة. قم بإثارة roGFP2-Orp1 مع مرشحات الإثارة 405/20 و 480/30 نانومتر بالتتابع واحصل على صور بمرشح انبعاث 535/30 نانومتر بعد اجتياز ضوء الانبعاث المرآة ثنائية اللون 505DCXR.
7. بعد التقاط المجموعة الأولى من الصور ، تبادل الوسائط مع الوسائط التي تحتوي على حلول معالجة مختلفة. يجب تغيير الوسائط كل 30 دقيقة من التصوير لتجنب تغيرات الأس الهيدروجيني والأسمولية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات طبق ثقافة 35 مم سارستيدت 83-3900 غطاء زجاجي كورنينج 2850-22 أطباق بتري يمكن التخلص منها (100 × 15 مم) VWR هاتف: 25384-094 مصل الأبقار الجنينية ثيرموفيشر العلمي 26140087 مجهر مقلوب نيكون TE2000 لامينين ثيرموفيشر العلمي 23017-015 L-15 متوسط من Leibovitz مع أحمر الفينول جيبكو / فيشر ساینتفيك 11-415-064 L-15 من Leibovitz متوسط بدون فينول أحمر جيبكو / فيشر ساینتفيك 21-083-027 البنسلين / الستربتومايسين ثيرموفيشر العلمي 15140122 الفينول الأحمر سيجما ألديتش P0290 بولي د-يسين (PDL) سيجما ألديتش P7280 مرشح Steritop 0.22 ميكرومتر ميليبور S2GPT05RE ثنائي هيدرات كلوريد الكالسيوم فيشر ساينتيك سي 79-500 الجلوكوز سيجما ألدريتش جي 7528 هيبس سيجما ألدريتش إتش 4034