إنشاء تكوين خلية كاملة لتصوير الكالسيوم ثنائي الفوتون لشرائح الدماغ

الملخص

المصدر: Camiré, O., et al. تصوير الكالسيوم ثنائي الفوتون في التشعبات العصبية في شرائح الدماغ. J. Vis. Exp. (2018).

يوضح هذا الفيديو بروتوكولا لتسجيل مشبك التصحيح للخلية بأكملها وتصوير الكالسيوم ثنائي الفوتون في شرائح الحصين في الدماغ. تسمح هذه الطريقة بدراسة ديناميكيات الكاسيفورم²⁺ العابرين (CaTs) في التشعبات من أنواع الخلايا العصبية المختلفة في شرائح الدماغ الحادة.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل المراجعة الأخلاقية المناسبة للحيوانات.

< ص الفئة = "jove_title" >1. التحضير الأولي (اختياري: الاستعداد قبل يوم واحد)

1. تحضير ثلاثة أنواع من محلول السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي (المحاليل العادية والسكروز والتعافي ، 1 لتر لكل منهما ؛ انظر الجدول 1). اضبط أسمولية المحاليل على 300 ± 10 مللي أسم وتبريد ACSF-Sucrose وصولا إلى نقطة تجمد قريبة (0-4 درجة مئوية).
   ملاحظه: يساعد استخدام محلول القطع منخفض الصوديوم (ACSF-Sucrose) في الحفاظ على صلاحية الخلايا العصبية في الطبقات السطحية للشرائح الحادة.
2. قم بإعداد 0.75 مل من محلول التصحيح الذي يحتوي على فلوروفور أحمر (على سبيل المثال ، Alexa-594) ومؤشر كالسيوم اصطناعي أخضر (على سبيل المثال ، Oregon Green BAPTA-1 ؛ انظر الجدول 1). قم بتضمين biocytin (انظر الجدول 1) في محلول التصحيح إذا كان التحديد المورفولوجي اللاحق للخلايا المسجلة مطلوبا.
3. اضبط أسمولية المحلول على 280 ± 5 مللي أسم ودرجة الحموضة إلى 7.35 ± 0.5. احتفظ بالمحلول في الثلاجة أو على الثلج في جميع الأوقات.
   ملاحظه: يجب أن يعتمد اختيار مؤشر الكالسيوم على نطاقه الديناميكي وعلى طبيعة أحداث Ca²⁺ التي تم فحصها.
4. باستخدام مجتذب الماصات الدقيقة، قم بإعداد ماصات رقعة من الشعيرات الدموية الزجاجية للبورسليكات (انظر جدول المواد) بطرف ≈ 2 ميكرومتر (مقاومة الماصة من 3-5 MΩ) وماصات التحفيز من الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات (انظر جدول المواد) بطرف 2-5 ميكرومتر.
   ملاحظه: سيتم تحديد إعدادات الساحب/التصغير لصنع الماصات بقطر وشكل معينين حسب نوع خيوط الساحب، ونتائج اختبار المنحدر لنوع معين من الزجاج.

< p class = "jove_title" >2. تسجيلات مشبك التصحيح للخلية الكاملة

1. ضع شريحة الحصين في مكانها في حمام موضوعة تحت الهدف (التكبير: 40x ، الفتحة العددية: 0.8) لمجهر ثنائي الفوتون بالمسح بالليزر. قم باستمرار بتسخين الحمام باستخدام ACSF-Normal المؤكسج المسخن عند 30-32 درجة مئوية بمعدل 2.5-3 مل / دقيقة.
2. استخدم تباين التداخل التفاضلي بالأشعة تحت الحمراء (IR-DIC) أو الفحص المجهري Dodt-SGC لتحديد موقع الخلية ذات الأهمية باستخدام حجمها وشكلها وموضعها.
   ملاحظه: اعتمادا على مجموعة الخلايا العصبية المستهدفة ، يمكن استخدام نموذج الفأر المعدل وراثيا لتحديد موقع الخلايا ذات الأهمية بسهولة. في هذه الحالة ، يمكن استبدال هذه الخطوة باستخدام مصدر ضوء الفلورسنت.
3. املأ ماصة التحفيز بمحلول ACSF-Normal الذي يحتوي على الفلوروفور الأحمر (على سبيل المثال، Alexa-594).
4. اضبط ماصة التحفيز (المتصلة بوحدة التحفيز الكهربائي) أعلى الشريحة بحيث يكون الطرف في نفس منطقة الخلية محل الاهتمام.
5. بعد ملء ماصة التصحيح بمحلول التصحيح وربطها بمرحلة الرأس ، ضعها فوق الشريحة بحيث يكون طرفها فوق الخلية محل الاهتمام مباشرة.
6. ضع حقنة في محبس ثلاثي الاتجاهات وقم بتوصيلها بماصة التصحيح من خلال الأنبوب البلاستيكي. قم بحقن ضغط إيجابي ثابت في ماصة التصحيح (≈ 0.1 مل) باستخدام المحقنة. احتفظ بالمحبس في وضع "قريب".
7. قم بتنشيط وحدة برنامج التحكم في مكبر الصوت وقم بالتبديل إلى وضع مشبك الجهد بالنقر فوق الزر "VC". افتح برنامج الحصول على بيانات الفيزيولوجيا الكهربية (على سبيل المثال ، المشامن) للحصول على إشارات الفيزيولوجيا الكهربية وانقر على أيقونة "اختبار الغشاء" لجعله يرسل باستمرار نبضة جهد مربع (5 مللي فولت ، 10 مللي ثانية) ، وهو أمر ضروري لمراقبة التغيرات في مقاومة الماصة.
8. اخفض ماصة التصحيح حتى تصبح أعلى الخلية المستهدفة مباشرة. عند ملامسة غشاء الخلية ، قم بإزالة الضغط عن طريق تحويل محبس المحبس إلى الوضع "المفتوح".
   ملاحظه: يتم الكشف عن ملامسة غشاء الخلية عند رؤية زيادة طفيفة في مقاومة الماصة (≈ 0.2 MΩ) ، وتحدث مسافة بادئة صغيرة على الخلية بسبب الضغط الإيجابي.
9. قم بتطبيق ضغط سلبي طفيف على ماصة التصحيح باستخدام حقنة فارغة مثبتة في محبس حتى تصل مقاومة الماصة التي يوفرها البرنامج إلى 1 جيجاأوم. في نافذة "اختبار الغشاء" لبرنامج الحصول على البيانات ، قم بتثبيت الخلية عند -60 مللي فولت.
10. استمر في الضغط السلبي حتى يتم فتح الخلية وتحقيق تكوين الخلية بأكملها. يعتمد اكتشاف حالة الخلية هذه على التغيير المفاجئ في مقاومة الماصة (من 1 GΩ إلى 70-500 MΩ اعتمادا على نوع الخلايا العصبية الداخلية) وظهور عابرات سعوية كبيرة في نافذة "اختبار الغشاء".

< p class = "jove_title" >3. الكالسيوم ثنائي الفوتون (Ca²⁺) التصوير

1. إذا كنت مهتما بالاستجابات المثيرة بعد المشبكي ، فقم بإضافة مانع مستقبلات GABAA جابازين (10 ميكرومتر) وحاصرات مستقبلات GABAB CGP55845 (2 ميكرومتر) إلى حمام ACSF.
2. في وحدة برنامج التحكم في مكبر الصوت ، اضبط تكوين التصحيح على المشبك الحالي بالنقر فوق الزر "CC" وسجل نمط إطلاق الخلية استجابة للحقن الجسدي لتيار إزالة الاستقطاب (0.8-1.0 نانو أمبير ، 1 ثانية). انتظر لمدة 30 دقيقة على الأقل حتى تمتلئ الخلية بالمؤشرات الموجودة في محلول التصحيح.
   ملاحظه: يمكن استخدام نمط إطلاق الخلية وخصائصها النشطة لتحديد نوعها الفرعي ، على سبيل المثال ، الخلايا سريعة الارتفاع. من المهم أن يستقر تركيز المؤشر من خلال الانتشار قبل البدء في تسجيل عابرات الكالسيوم (CaTs) (انظر الجدول 2 لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها).
3. CATs التي تم استحضارها بواسطة AP
   1. باستخدام برنامج الحصول على الصور ، ابدأ في الحصول على الصور. حدد موقع التغصنات ذات الأهمية باستخدام إشارة التألق الأحمر. لضمان استجابة مرئية ، أولا ، اختر التغصنات القريبة (≤ 50 ميكرومتر) حيث قد تنخفض كفاءة الانتشار الخلفي AP بشكل كبير مع المسافة في الخلايا العصبية الداخلية GABAergic.
   2. باستخدام "الأداة المستطيلة" في برنامج الحصول على الصور ، قم بتكبير المنطقة المستهدفة وقم بالتبديل إلى وضع "xt" (linecan). ضع الفحص عبر الفرع الشجيري محل الاهتمام. باستخدام وحدات التحكم في شدة الليزر في برنامج الاستحواذ ، اضبط ليزر الفوتون الثنائي على الحد الأدنى من مستوى الطاقة حيث يكون التألق الأخضر الأساسي مرئيا قليلا لتجنب السمية الضوئية.
   3. في نافذة برنامج الحصول على بيانات الفيزيولوجيا الكهربية "بروتوكول" وبرنامج الحصول على الصور ، قم بإنشاء تجربة تسجيل للمدة المطلوبة تحتوي على حقن تيار جسدي للسعة المطلوبة.
      1. باستخدام برنامج الحصول على الصور ، انقر فوق الزر "بدء التسجيل" واحصل على التألق بشكل مستمر لمدة 1-2 ثانية. كرر الحصول على الصورة 3-10 مرات. انتظر 30 ثانية على الأقل بين عمليات المسح الفردية لتجنب تلف الضوء. إذا كنت تحصل على linecans في نقاط متعددة على طول التغصنات ، فخذها بترتيب عشوائي لتجنب تأثيرات الطلب.
4. CaTs المستحثة بشكل متشابك
   1. حدد موقع التغصنات ذات الأهمية باستخدام إشارة التألق الأحمر.
   2. ضع ماصة التحفيز على سطح الشريحة فوق التغصنات المعنية. اخفض ماصة التحفيز ببطء في مكانها، لتقليل الحركة لتجنب إزعاج تكوين الخلية بأكملها. ضع الماصة على بعد 10-15 ميكرومتر من التغصن.
   3. لتصور موقع النطاقات الدقيقة المشبكية في التشعبات الشوكية ، في برنامج الحصول على الصور ، قم بالتبديل إلى وضع "xt" (linecan) ووضع الخط على طول الفرع الشجيري محل الاهتمام.
   4. في نافذة "البروتوكول" (لبرنامج الحصول على بيانات الفيزيولوجيا الكهربية) وبرنامج الحصول على الصور ، قم بإنشاء تجربة تسجيل تؤدي إلى تشغيل وحدة التحفيز بعد بدء التجربة.
   5. باستخدام برنامج الاستحواذ ، انقر فوق الزر "بدء التسجيل" للمسح الضوئي على طول التغصنات بشكل مستمر لمدة 1-2 ثانية. كرر الاستحواذ 3-5 مرات ، وانتظر 30 ثانية بين عمليات المسح لمنع التلف الضوئي.
      ملاحظه: يمكن ضبط طول الفحص اعتمادا على حركية الحدث المستحث ولكن يجب تقليله لمنع التلف الضوئي (انظر الجدول 2 لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها).
   6. كرر الخطوة 3.4.5 في ظروف مختلفة (على سبيل المثال ، شدة / طول مختلفة للتحفيز ، إدخال مانع دوائي ، إلخ) اعتمادا على السؤال المحدد الذي يتم تناوله.
   7. أوقف الاستحواذ عندما تظهر على الخلية علامات تدهور الصحة: إزالة الاستقطاب أقل من -45 مللي فولت ، وزيادة في مستوى خط الأساس Ca²⁺ ، والتدهور المورفولوجي للتشعبات (على سبيل المثال ، الرقاع ، والتجزئة ؛ انظر الجدول 2 لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها).
   8. للحصول على معلومات أولية عن مورفولوجيا الخلية والاحتفاظ بسجل لموقع ماصة التحفيز ، احصل على مكدس Z للخلية في القناة الحمراء. باستخدام برنامج الاستحواذ في وضع "xyz" ، قم بتعيين حدود المكدس العلوية والسفلية لتصوير الخلية بأكملها مع تضمين جميع العمليات. اضبط "حجم الخطوة" على 1 ميكرومتر وابدأ اكتساب المكدس باستخدام زر "بدء التسجيل".
   9. عند اكتمال اكتساب Z-stack ، استخدم خيار "الحد الأقصى للإسقاط" في البرنامج لتركيب جميع الخطط البؤرية للمكدس والتحقق من جودة الاستحواذ. ثم اسحب ماصة التصحيح ببطء من الشريحة.
   10. لإصلاح الشريحة لتحديد المورفولوجية اللاحقة ، قم بإزالة الشريحة بسرعة من الحمام باستخدام فرشاة طلاء مسطحة وضعها بين ورقتي ترشيح في طبق بتري مملوء ب ACSF. استبدل ACSF بمحلول بارافورمالديهايد (PFA) بنسبة 4٪ واترك الطبق في غرفة أو ثلاجة 4 درجات مئوية طوال الليل.

الجدول 1: وصفات الحل. مركبات وتركيزات المحاليل المستخدمة أثناء البروتوكول.

حل مكون التركيز (مللي متر) ACSF-عادي كلوريد الصوديوم 124 كيه سي إل 2.5 NaH2PO4 1.25 MgSO4 2 NaHCO3 26 الجلوكوز 10 CaCl2 2 ACSF-Recovery كلوريد الصوديوم 124 كيه سي إل 2.5 NaH2PO4 1.25 MgSO4 3 NaHCO3 26 الجلوكوز 10 CaCl2 1 ACSF-Sucrose كيه سي إل 2 NaH2PO4 1.25 MgSO4 7 NaHCO3 26 الجلوكوز 10 سكروز 219 CaCl2 1 K + ك + غلوكونات 130 هيبس 10 كلوريد المغنيسيوم 2 2 ملح فوسفوكرياتين دي (تريس) 10 ATP-تريس 2 GTP-تريس 0.2 بيوسيتين 72 اليكسا -594 0.02 أوريغون جرين - بابتا -1 0.2

الجدول 2: جدول استكشاف الأخطاء وإصلاحها. حلول للمشكلات الشائعة التي قد تنشأ أثناء تجربة تصوير Ca²⁺.

مشكلة حل غير قادر على تصحيح الخلايا العصبية السليمة تحقق من وجود علامات تدل على أن الشرائح غير صحية: الخلايا المنكمشة أو المنتفخة ، والنوى المرئية ، وما إلى ذلك. إذا كان الأمر كذلك ، فتخلص من الشرائح. تحقق أيضا من مقاومة الماصة الرقعة والأسمولية لمحلول الرقعة. استبدلها إذا لم تكن القيم في النطاق المناسب. إشارة التألق من التشعبات منخفضة انتظر لفترة أطول حتى تمتلئ الخلية. إذا كان الانسداد يمنع محلول الرقعة من الانتشار في الخلية، فحاول تطبيق كمية صغيرة من الضغط السلبي في الماصة. التحفيز الكهربائي لا يثير استجابة Ca²⁺ تحقق من وجود قطعة أثرية في التسجيل الفيزيولوجي الكهربي. في حالة عدم وجوده ، تحقق من وجود عطل في ماس كهربائى / وحدة التحفيز. إذا كان موجودا، ارفع شدة التحفيز أو حرك ماصة التحفيز بالقرب من التغصنات. وتجدر الإشارة إلى أن المسافة بين قطب التحفيز والتغصنات يجب ألا تتجاوز 8 ميكرومتر لمنع إزالة الاستقطاب المباشر للتشعبات عند دراسة الاستجابات المتشابكة. إشارة Ca²⁺ المستحثة عالية جدا / تشبع مؤشر Ca²⁺ تقليل طاقة الليزر. إذا استمرت المشكلة في خلايا متعددة ، فاستخدم مؤشر Ca²⁺ مختلفا مع تقارب Ca²⁺ أقل. تزداد إشارة خط الأساس Ca²⁺ تدريجيا أثناء التجربة انتظر لفترة أطول بين عمليات الفحص الفردية. إذا كان خط الأساس لا يزال في ازدياد ، فتوقف عن الاستحواذ. يشير إلى أن صحة الخلية من المحتمل أن تتدهور. ينخفض اتساع إشارة Ca²⁺ أثناء عمليات المسح تقليل طاقة الليزر أو التصغير (إن أمكن). التغصنات تتجزئة ("الفقاع") بعد المسح تقليل طاقة الليزر أو التصغير. إذا كان الرقيق يقتصر على التغصنات المستهدفة ، فاختر تغصنا آخر وقلل من طاقة الليزر / التصغير. إذا كانت التشعبات المتعددة تنفجر ، فأوقف الاستحواذ. إشارات التألق "تنجرف" خارج خط المسح بعد عمليات المسح قلل الحركة في الشريحة عن طريق تقليل سرعة تروية ACSF. قبل الترقيع ، تأكد من تثبيت الشريحة بقوة في مكانها بواسطة شبكة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات سلالة: Mouse CD1 نهر تشارلز 22 كلوريد الكالسيوم سيجما ألدريتش سي 4901 د- (+) - جلوكوز سيجما ألدريتش G8270 هيبس سيجما ألدريتش إتش 3375 كلوريد المغنيسيوم سيجما ألدريتش M8266 كبريتات المغنيسيوم هيبتاهيدرات سيجما ألدريتش 230391 مسحوق بارافورمالدهايد ، 95٪ سيجما ألدريتش 158127 كلوريد البوتاسيوم سيجما ألدريتش ص 3911 غلوكونات البوتاسيوم سيجما ألدريتش ص 1847 أزيد الصوديوم سيجما ألدريتش S2002 بيكربونات الصوديوم سيجما ألدريتش S8875 كلوريد الصوديوم سيجما ألدريتش S5886 سكروز سيجما ألدريتش S9378 تريتون X-100 سيجما ألدريتش تي 9284 قاعدة Trizma سيجما ألدريتش [ت1503] تريزما هيدروكلوريد سيجما ألدريتش تي 3253 ثنائي هيدرات فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة سيجما ألدريتش 71643 فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة
مونوهيدرات سيجما ألدريتش إس 9638 بيوسيتين سيجما ألدريتش ب 4261 أليكسا فلور 594 هيدرازيد ثيرموفيشر العلمي أ 10438 SR95531 (غابازين) أبكام أب120042 أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) - تريس سيجما ألدريتش أ 9062 غوانوزين (GTP) - Na + سيجما ألدريتش G8877 أوريغون جرين بابتا -1 ثيرموفيشر العلمي O6812 ملح فوسفوكرياتين دي (تريس) سيجما ألدريتش ص 1937 Alexa-546 المترافق مع الستربتافيدين ثيرموفيشر العلمي س 11225 تصحيح الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات أدوات الدقة العالمية 1ب 100 إف -4 الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات ثيتا أداة سوتر BT-150-10 P-97 مجتذب الماصات الدقيقة المشتعلة / البني أداة سوتر TCS SP5 مجهر متعدد الفوتون متحد البؤر لايكا مايكروسيستمز Chameleon Ultra II Ti: ليزر متعدد الفوتون من الياقوت متماسك برنامج الحصول على التصوير بالتركيز البؤري التلقائي LAS لايكا مايكروسيستمز جهاز التحكم في درجة الحرارة TC-324B وارنر إنسترومنتس مكبر للصوت MultiClamp 700B الأجهزة الجزيئية محول رقمي Digidata 1440A الأجهزة الجزيئية مترجم متحد البؤر سيسكيو معالج دقيق سيسكيو برنامج الحصول على البيانات pClamp الأجهزة الجزيئية A365 عازل تحفيز التيار المستمر أدوات الدقة العالمية الجدول البصري الاهتزازي الأنظمة الحركية