الحقن المجهري للدواء مع التسجيل الفيزيولوجي الكهربي في دماغ الفئران

الملخص

المصدر: Lai, J., et al. تسجيل الفيزيولوجيا الكهربية المتزامنة والحقن الدقيقة للعوامل المثبطة في دماغ القوارض. J. Vis. Exp. (2015)

يحدد هذا البروتوكول تجميع واستخدام الحقن لتوصيل الدواء بدقة إلى مناطق الدماغ المستهدفة للفأر المخدر ، متبوعا بمراقبة النشاط العصبي من خلال الإشارات الكهربائية المسجلة.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. تجميع ماصة التسجيل والحقن

1. اسحب شعيرات دموية زجاجية بطول 7 سم تقريبا (قطر خارجي 1 مم) باستخدام مجتذب ماصة.
2. كسر الطرف الشعري وتحقق من الفتحة تحت المجهر الضوئي. تأكد من أن القطر الداخلي يتراوح بين 30 ميكرومتر إلى 40 ميكرومتر.
3. أدخل سلكا فضيا بطول 7 سم في الشعيرات الدموية الزجاجية مع بروز 1 سم تقريبا من الطرف غير المدبب للماصة الزجاجية.
4. ثني الخيط الزائد بشكل متعامد إلى الشعيرات الدموية الزجاجية.
5. ضع قطرة من مادة لاصقة بلاستيكية مرنة على عمود إبرة تحت الجلد 30 جراما.
6. أدخل إبرة تحت الجلد 30 جم في الماصة الزجاجية وفقا للمخططات المعروضة في الشكل 1.
7. أضف طبقة غراء ثانية لضمان الختم المناسب من الوصلة بين الماصة الزجاجية والإبرة تحت الجلد.
8. اترك الماصة حتى تجف مع توجيه الطرف لأعلى لمدة 12 ساعة تقريبا لضمان المعالجة المناسبة للغراء. تظهر النتيجة النهائية في الشكل 2.

ملاحظة: يتم إجراء هذا الإجراء في التجارب الحادة ، ولا يلزم تعقيم طرف الماصة.

< p class = "jove_title" >2. تحضير

1. ضع الجرذ في صندوق التخدير.
2. تحفيز التخدير باستخدام 4٪ أيزوفلوران لمدة 5 إلى 10 دقائق.
3. ضع على طاولة تجسيمية مع وسادة تدفئة ومسبار المستقيم للحفاظ على درجة حرارة الجسم 37 درجة مئوية. استخدم مخروط الأنف مع 2٪ إيزوفلوران للحفاظ على التخدير. قم بتأمين رأس الجرذ باستخدام قضبان الأذن وحامل الأسنان.
4. ضع مرهما للعين أو قطرات العين ، بما في ذلك قطرات الأتروبين 1٪ ، للمساعدة في توسيع حدقة العين. لمنع الجفاف ، ضع قطرات التشحيم كل 30 دقيقة تقريبا.
5. احلق الرأس ونظفه باستخدام 10٪ بوفيدون اليود.
6. للتخدير الموضعي ، قم بحقن 0.5 مل من الليدوكائين 2٪ تحت فروة الرأس في 2-3 مواقع عن طريق رفع الجلد وإدخال طرف الإبرة.
7. تأكد من مستوى مناسب من التخدير عن طريق إجراء قرصة إصبع القدم وملاحظة قلة الحركة. بالإضافة إلى ذلك ، يجب مراقبة معدل ضربات القلب للتأكد من أنه ضمن القيم الطبيعية (300 إلى 400 نبضة / دقيقة).
8. شق فروة الرأس في خط مستقيم على طول الوسيط بشفرة مشرط # 10 لكشف كل من الغرز الإكليلية والسهمية.
9. اكشف عن نقطتي Lambda و Bregma عن طريق دفع الأنسجة التي تغطي الجمجمة جانبا باستخدام ملعقة جراحية.
10. قم بتسوية الجمجمة بحيث تكون مواضع Bregma و Lambda على نفس المستوى.
11. لتعيين النقطة المرجعية ، استخدم جهازا مجسما مع أنبوب زجاجي مركب لضبطه فوق Bregma مباشرة. سيكون هذا هو "الصفر" لإحداثيات القياس الأمامي الخلفي والإنسي الجانبي.
12. قم بتعيين نقطة الاهتمام عن طريق تحريك الحامل التجسيمي إلى الإحداثيات المطلوبة ، ولاحظ الإحداثيات التجسيمية ، وارسم مربعا حول المنطقة المستهدفة التي تحدد مكان إجراء حج القحف.
13. استخدم مثقابا جراحيا مع مثقاب معقم على طول المربع المحدد ببطء دون ضغط لإزالة مادة العظام. احرص على عدم الحفر لفترة طويلة في نفس المنطقة ، لأنها ستنتج حرارة وتسبب آفات في القشرة.
14. عندما يصبح العظم الذي يحدد حج القحف رقيقا بدرجة كافية ، قم بإزالة الجزء الجمجمي بعناية باستخدام ملاقط لكشف القشرة.
15. كثيرا ما يروي القشرة المكشوفة بالسائل الشوكي الدماغي الاصطناعي لمنع جفاف الأنسجة.
    ملاحظه: إزالة الأم الجافية غير ضرورية على الجرذ لأن طرف الحقن قوي بما يكفي للاختراق.

< p class = "jove_title" >3. تعبئة وتركيب نظام الحقن

1. املأ المحقنة الدقيقة سعة 5-10 ميكرولتر عن طريق الشفط بالزيت المعدني.
2. املأ الإبرة تحت الجلد بالماصة الزجاجية الثابتة بمحلول 0.5٪ Chicago Sky Blue (CSB) و 300 ميكرومتر من حمض γ-أمينوبوتيريك (GABA) أو محلول 2٪ ليدوكائين مع 0.5٪ CSB 9. خفف جميع المحاليل بالمحلول الملحي.
   1. في حالة وجود مادة وفيرة ، املأ باستخدام حقنة عادية واستخدم التقنيات الوقائية المعتادة لتجنب تكوين فقاعات الهواء.
   2. في حالة المواد الأكثر تكلفة ، يمكن استخدام الزيت المعدني لملء الحقن ، ويمكن بعد ذلك إدخال العامل الكيميائي عن طريق الشفط. فرق الكثافة بين الزيت المعدني والماء مرتفع نسبيا ، لذا فإن هذه المادة مرشحة جيدة لحقن المحاليل المائية.
      ملاحظه: يمكن إضافة صبغة لتأكيد الفصل بين كلا السائلين.
3. لملء ماصة الحقن، قم بشفط حقنة سعة 1 مل بالمحلول وحقنها ببطء في الماصة.
4. انتبه جيدا للتسربات في المناطق المشار إليها في الشكل 1 عن طريق مسح هذه المناطق نظيفة ومراقبة التسريبات عن طريق حقن المحلول ببطء بالمحقنة.
5. قم بإزالة حقنة 1 مل. عند القيام بذلك ، حافظ على الضغط الخفيف على المكبس حتى لا يزيل الفراغ المحلول من ماصة الحقن.
6. قم بشفط المحقنة الدقيقة بالزيت المعدني وقم بتوصيلها بإحكام بماصة الحقن المملوءة. بعد ذلك ، امسح بعناية أي محلول زائد من الحقن المجمع بالشاش.
7. قم بحقن حجم صغير جدا ، يكفي لرؤية شكل قطرة صغيرة عند طرف الماصة الزجاجية ، للتحقق من عدم انسداد الطرف.
8. قم بتركيب الحقن على نظام المضخة الدقيقة وتأكد من إصلاحه جيدا.
9. ضع طرف الحقن بعناية عند الإحداثيات المستهدفة وقم بخفض الطرف إلى سطح القشرة.
10. قم بخفض الحقن ببطء باستخدام الجهاز التجسيمي إلى البنية المستهدفة (القولون العلوي) باستخدام الإحداثيات التشريحية المناسبة.
11. قم بتغطية القشرة المكشوفة بأجار دافئ لمنع جفاف الأنسجة.

< p class = "jove_title" >4. الحقن والتعطيل القابل للانعكاس

1. اضبط مضخة الحقن المجهري على حقن 400 إلى 800 نيولتر عند 40 nl / دقيقة واضغط على Run لبدء الحقن. لاحظ أن معدل الارتفاع سيظهر انخفاضا أثناء الحقن.
   ملاحظة: في الإعداد التجريبي ، تعافى النشاط العصبي في غضون ساعة بعد نهاية تسليم GABA. يمكن استخدام أي جهاز ميكانيكي معاير للضغط على حقنة الحقن المجهري وإجراء الحقن.
2. بعد الحصول على البيانات الفيزيولوجية الكهربية ، القتل الرحيم باستخدام طريقة معتمدة من قبل مجتمع أخلاقيات المحلي.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: تمثيل تخطيطي لمجموعة الحقن. يتم توصيل محقنة دقيقة (A) بماصة التسجيل والحقن ، والتي تتكون من إبرة تحت الجلد 30 جم (B) ملتصقة بسلك فضي (C) داخل ماصة زجاجية (D). تسلط المناطق المحاطة بدائرة (E-F) الضوء على المناطق التي قد تكون عرضة للتسربات.

< p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مضخة الحقن (UltraMicroPump III) WPI #UMP3 وحدة التحكم في الحقن (وحدة تحكم Micro4) WPI #SYS-ميكرو 4 حقنة هاميلتون هامليتون (80301) 701LT 10 ميكرولتر SYR محاقن بين 5 و 10 ميكرولتر مستخدمة جل لاصق سيانواكريليت كرازي غراء KG86648R من السهل تطبيق شكل الجل على عمود الإبرة تحت الجلد 30G الماصات الزجاجية WPI #TW100F-4 جدار رقيق ، OD 1 مم ، معرف 0.75 مم مع ماصات خيوط مستخدمة 720 مجتذب ماصة إبرة كوبف 720 ريال سلك فضي شركة إيه إم سيستمز 782500 عارية 0.010 " اجار أنابيب شعرية إبرة تحت الجلد شيكاغو سكاي بلو (CSB) حمض γ أمينوبوتيريك (GABA) ليدوكائين قطرات الأتروبين إيزوفلوران وسادة التدفئة جدول التجسيم # 10 شفرة مشرط الزيوت المعدنية