تسجيل تيارات الخلية الكاملة مع نفخ GABA في شريحة دماغ الفأر

الملخص

المصدر: Feng، Y. et al. ، تيارات الخلية الكاملة الناجمة عن تطبيق نفخة GABA في شرائح الدماغ.J. Vis. Exp. (2017)

يوضح هذا الفيديو تسجيل تيارات الخلية الكاملة التي يسببها حمض جاما أمينوبوتيريك ، أو GABA ، في شريحة الدماغ القشرية الأمامية للفأر. يفتح التسليم المتحكم فيه ل GABA قنوات الكلوريد في الخلايا العصبية بعد المشبكي ، مما يولد تيارات مثبطة لما بعد المشبكي ، أو IPSCs. تزداد هذه IPSCs مع تركيزات GABA أعلى ، مما يعكس النشاط المثبط ل GABA على الانتقال المتشابك.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.

< p class = "jove_title" >1. إعداد الحلول

1. تحضير 500 مل من السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي القياسي (ACSF) الذي يحتوي على المكونات الموضحة في عملنا المنشور كما هو مذكور في الجدول 1.
   1. استخدم أكواب زجاجية نظيفة بالماء منزوع الأيونات لتحضير محلول ACSF طازج. نظف الملاعق بالماء منزوع الأيونات وجففها قبل استخدامها لإضافة كلوريد الصوديوم (NaCl) ، وكلوريد البوتاسيوم (KCl) ، وفوسفات الصوديوم ثنائي الهيدروجين (NaH₂PO₄) ، وثنائي كربونات الصوديوم (NaHCO₃) ، وكبريتات المغنيسيوم (MgSO₄) ، D-glucose ، وإضافة كلوريد الكالسيوم (CaCl₂) بعد فقاعات المحلول بنسبة 95٪ O₂ / 5٪ CO₂خليط لمدة ~ 20 دقيقة (كما هو مفصل في الجدول 1) إلى 500 مل من الماء منزوع الأيونات. يقلب حتى يذوب تماما.
   2. تأكد من أن ACSF واضح تماما دون أي هطول الأمطار. ثم اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.2-7.4. فقاعة بخليط غاز يتكون من 95٪ O₂ و 5٪ CO₂ لمدة ~ 20 دقيقة.
2. تحضير 250 مل من محلول قطع الشرائح الذي يحتوي على المواد الكيميائية الموضحة في الجدول 2.
   1. أضف KCl ، كلوريد المغنيسيوم (MgCl₂) ، NaH₂PO₄ ، NaHCO₃ ، الكولين ·Cl ، و D-الجلوكوز وأضف كلوريد الكالسيوم (CaCl₂) أخيرا كما هو موضح في 1.1.1 ، إلى 250 مل من الماء منزوع الأيونات ويذوب كما هو موضح في 1.1.1 و 1.1.2.
   2. بعد غلي 95٪ O₂/5٪ CO₂ ، ضع المحلول في الفريزر لمدة 15-20 دقيقة حتى يصبح محلول التقطيع باردا مثلجا ومجمدا جزئيا.
      ملاحظه: نستخدم محلول القطع هذا عند صنع شرائح من الفئران البالغة من العمر 1-2 شهر. قد تختلف الصيغة بالنسبة للفئران التي يزيد عمرها عن شهرين.
   3. تحضير محلول عديد السكاريد الدهني (LPS) عن طريق إذابته في محلول ملحي متساوي التوتر معقم خال من السموم الداخلية (0.9٪ كلوريد الصوديوم). يتم إعطاء LPS داخل الصفاق (0.5 مجم / كغ) ويبدأ التسجيل بعد ساعتين.

< p class = "jove_title" >2. تحضير شريحة قشرة الفص الجبهي

1. أخرج محلول القطع من الفريزر وقم بتجانسه للحصول على مشروب سلاش. ضع المحلول على الثلج وفقاعات باستمرار مع 95٪ O₂/5٪ CO₂.
2. باستخدام مقص كبير وحاد ، قم بقطع رأس الفأر بسرعة كما هو موضح وضع الرأس على الفور في دورق مملوء بمحلول قطع مثلج (0-4 درجة مئوية).
3. اقطع الجزء العلوي من الجمجمة على طول خط الوسط في اتجاه الذيلية إلى الأنف بمقص ناعم وقم بإزالة أجزاء الجمجمة الجانبية. قم بإزالة الدماغ بملعقة دقيقة واسقطها في محلول التقطيع المثلج. < / > ملاحظه: يجب تنفيذ الخطوات 2.2-2.3 بسرعة (من الناحية المثالية < 1 دقيقة).
4. ضع الدماغ على غطاء طبق بتري 9 سم مليء بالثلج. شطف الدماغ بمحلول القطع المثلج. قطع المخيخ والبصلة الشمية بشفرة حلاقة.
5. ضع غراء سيانواكريليت على حامل عينة الاهتزاز. ضع كتلة الدماغ بعناية على قطرة الغراء ، والجانب المنقاري لأعلى ، وانغمس على الفور في محلول القطع المثلج.
6. اضبط حامل شفرة الاهتزاز بزاوية 15 درجة بالرجوع إلى المستوى الأفقي وقم بإعداد شرائح دماغية إكليلية بحجم 350 ميكرومتر (تردد اهتزاز الشفرة = 85 هرتز ، السرعة = 0.1 مم / ثانية).
7. باستخدام ماصة ، انقل الشرائح إلى غرفة الاسترداد المملوءة ب ACSF ، واحتضانها لمدة 1 ساعة (عند RT) مع فقاعات مستمرة بنسبة 95٪ O₂/5٪ CO₂.

< p class = "jove_title" >3. تسجيل تصحيح الخلية الكاملة

1. اصنع ماصات دقيقة من البورسليكات الزجاجية لاستخدامها كأقطاب تسجيل أو ماصات دقيقة نفخة وفقا للإرشادات المحددة في دليل تشغيل المجتذب. بالنسبة لتسجيل الأقطاب الكهربائية ، تكون مقاومات الأطراف في حدود 4-6 MΩ ، بينما تكون ماصات النفخة الدقيقة لها أقطار طرف في النطاق 2-5 ميكرومتر.
2. أضف مانع قناة Na ⁺ (Tetrodotoxin (TTX) ، 1 ميكرومتر) ، لمنع قناة Na ⁺ السريعة وبالتالي إمكانات العمل ، إلى ACSF والحفاظ على معدل تدفق ثابت لهذا المحلول من 2-3 مل / دقيقة في غرفة التسجيل ، عن طريق المضخة التمعجية في الغرفة والشفط منها قم بفقاعة ACSF بنسبة 95٪ O₂/5٪ CO₂ باستمرار لضمان صلاحية الشرائح.
3. انقل شريحة دماغية إلى غرفة التسجيل باستخدام ماصة باستور معدلة تم قطع طرفها الناعم ليناسب حجم الشريحة. قم بتغطية الشريحة بمرساة شريحة بلاتينية بخيوط نايلون متوازية متباعدة بمقدار ≥2 مم لتثبيت الشريحة على المنصة.
4. املأ الماصة الدقيقة المسجلة بمحلول داخلي (الجدول 3) واملأ الماصات الدقيقة النفخة بحمض جاما أمينوبوتيريك (GABA) عند 10 ميكرومتر و50 ميكرومتر و100 ميكرومتر (مذاب في ACSF) أو ACSF كتحكم في السيارة.
5. لمنع الانسداد بالحطام ، قم بالضغط الإيجابي الخفيف باستخدام حقنة 1 مل قبل غمر قطب التسجيل في ACSF. باستخدام معالج دقيق تحت المجهر (عدسة موضوعية 4x) ، ضع قطب التسجيل والماصة الدقيقة النفخة بحيث تظهر الأطراف في وسط صورة الفيديو في الشاشة (الشكل 1 أ).
6. اضبط تركيز المجهر (عدسة موضوعية 40x) مع خفض الماصة الدقيقة النفخة تدريجيا وضعها فوق الخلايا العصبية المسجلة بزاوية 45 درجة. حافظ على المسافة بين طرف الماصة الدقيقة النفخة والخلايا العصبية المسجلة بين 20-40 ميكرومتر (الشكل 1 ب). اقترب ببطء وحذر من الخلايا العصبية باستخدام قطب التسجيل ثم حرر الضغط الإيجابي. قم بتطبيق شفط ضعيف وقصير من خلال الأنبوب المتصل بحامل القطب الكهربائي لإنشاء ختم جيجا أوم.
7. حافظ على الجهد عند 0 مللي فولت. بعد تشكيل ختم جيجا أوم ، عوض عن السعة السريعة والبطيئة يدويا أو تلقائيا. ثم قم بتطبيق شفط قصير وقوي من خلال الأنبوب المذكور أعلاه للوصول إلى وضع الخلية الكاملة.
8. سجل eIPSC في وضع مشبك الجهد. قم بتطبيق ضغط غاز منخفض (نيتروجين ، 4 - 6 رطل لكل بوصة مربعة) على ماصة النفخة الدقيقة باستخدام Picospritzer يتم التحكم فيه بواسطة مولد خطوة جهد Master 8 لتوصيل نفث GABA مفردة أو مزدوجة (الشكل 2).

< p class = "jove_content" > الجدول 1. تسجيل ACSF.

مادة جم / مول التركيز (مللي متر) الوزن (جم / لتر) كلوريد الصوديوم 58.443 دولار 119 6.9547 كيه سي إل 74.551 دولار 2.5 0.1864 NaH₂PO₄ 137.99 1 0.1380 NaHCO₃ 84.007 26.2 [ا] 2.2010 MgSO₄ 120.366 دولار 1.3 0.1565 د-الجلوكوز 198.17 دولار 11 2.1799 [إك] كلوريد_{الهواء 2} 110.98 دولار 2.5 0.2775 < p class = "jove_content" > الجدول 2. حل قطع الشريحة.

مادة جم / مول التركيز (مللي متر) الوزن (جم / لتر) كيه سي إل 74.551 دولار 2.5 0.1864 مغنكلوريد₂ 95.211 [م] 7 0.6665 NaH₂PO₄ 137.99 1.25 0.1725 NaHCO₃ 84.007 25 2.1002 [م] الكولين ·Cl 139.63 دولار 115 16.0575 دولار د-الجلوكوز 198.17 دولار 7 1.3872 دولار كلوريد_{الهواء 2} 110.98 دولار 0.5 0.0555

الجدول 3. حل داخلي لتسجيلات التصحيح للخلية الكاملة.

مادة جم / مول التركيز (مللي متر) الوزن (جم / لتر) غلوكونات CS 328.052 دولار 100 32.8052 [م] سي إس إل 168.36 دولار 5 0.8418 هيبس 238.301 دولار 10 2.3830 دولار مغنكلوريد₂ 95.211 [م] 2 0.1904 كلوريد_{الهواء 2} 110.98 دولار 1 0.1110 بابتا 476.433 دولار 11 5.2408 نا₂ATP 551.1 دولار 4 2.2044 دولار نا₂GTP 523.2 [م] 0.4 0.2093

النتائج

الشكل 1. رسم تخطيطي للماصة الدقيقة النفخة وقطب التسجيل.
(أ) المسافة بين النفخة والماصات الدقيقة المسجلة. (ب) الماصة الدقيقة النفخة (على اليسار) وقطب التسجيل (على اليمين) على سطح شريحة الدماغ.

< p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 2. حصار Pi...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات ماصات البورسليكات الزجاجية الدقيقة أدوات الغالق BF150-86-10 القطر الخارجي 1.50 مم ؛ القطر الداخلي 0.86 مم مجتذب الماصات الدقيقة أدوات الغالق نموذج P-97 مجتذب الماصة الدقيقة المشتعلة / الحاجب أجهزة المعالجة الدقيقة أدوات الغالق النائب 285 مكبر للصوت يتم التحكم فيه بواسطة الكمبيوتر الأجهزة الجزيئية متعدد المشبك 700B نظام الاستحواذ الرقمي الأجهزة الجزيئية ديجي داتا 1440 أ كاميرا التصوير نيكون 2115001 معدات التفتيش مجهريه نيكون كسوف FN1 ماجستير 8 أ.م.ب.ي. محفز النبض Master-8 قطاعة الاهتزاز لايكا VT 1000S بيكوسبريتزر باركر هانيفين أنظمة الضغط لإخراج أحجام البيكولتر في أبحاث الخلايا شفرة الحلاقة جيليت 74 ثانية النسر الطائر شاشة الفيديو باناسونيك دبليو في-بي ام 1410 502 الغراء ديلي 7146 الغراء Cyanoacrylate مضخة تمعجية شركة شنغهاي JIA PENG BT100-1F كاميرا فيديو أوليمبوس أمريكا الطبية أولي -150 نقل الماصات بيولوجيكس 30-0138A1