إنشاء مشبك رقعة كامل الخلية للتسجيل الفيزيولوجي الكهربي من شبكية العين المسطحة

الملخص

المصدر: Tu, H., et al. تسجيل مشبك التصحيح لخلايا الانفجار النجمي في تحضير مسطح لشبكية الفأر المنزوعة للفئران. J. Vis. Exp. (2016).

يوضح هذا الفيديو تقنية مشبك التصحيح للخلية الكاملة للتسجيل الفيزيولوجي الكهربي من شبكية الفأر المسطحة. تستخدم ماصة زجاجية رفيعة مع قطب كهربائي للاقتراب من خلايا الانفجار النجمي (SACs) داخل شبكية العين. بعد تشكيل الختم ، يتم تطبيق الشفط لتمزيق الغشاء وتشكيل تكوين مشبك التصحيح للخلية بأكملها. أخيرا ، يتم قياس تدفق الأيونات عبر المستقبلات المشبكية SAC باستخدام التكوين.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

1. الحلول الخارجية والداخلية

1. استخدم محلول Ringer للثدييات أثناء تشريح الشبكية وكمحلول خارجي في التسجيل الفيزيولوجي الكهربي اللاحق. قم بإعداد محلول Ringer للثدييات من محلول مخزون 10x (بدون الكالسيوم) في يوم التسجيل ، وأضف CaCl₂ قطريا بعد 15 دقيقة من الكربوجين (95٪ O₂ و 5٪ CO₂). يحتوي المحلول النهائي 1x (بالملليمتر): 120 كلوريد الصوديوم ، 5 كيلولولاريتر ، 25 هيدروكلوريد الصوديوم₃ ، 0.8 Na₂HPO₄ ، 0.1 NaH₂PO₄ ، 2 CaCl₂ ، 1 MgSO₄ و 10 D-glucose.
2. استخدم حلين داخليين لتوصيف تذبذبات SAC. اختبر فائدة المحاليل المحضرة في تسجيلات مشبك التصحيح لكامل الخلية المطولة على الخلايا العقدية الشبكية للفأر البالغ (RGCs) وقم بتخزين الدفعات التي تم التحقق منها في 500 ميكرولتر عند -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
   1. لتسجيل تذبذب الغشاء المحتمل ، استخدم محلولا داخليا قائما على البوتاسيوم يحتوي على (بالمللي مولار): 125 ك.1 كلوريد الصوديوم ، 4 أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) -Mg ، 0.5 Li-guanosine triphosphate (GTP) ، 5 حمض إيثيلين جلايكول رباعي الأسيتيك (EGTA) ، 10 4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبرازينات إيثان سلفونيك حمض (HEPES) و 0.2٪ بيويسيتين (وزن / حجم). اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.3 باستخدام KOH.
   2. لتسجيل التيارات المثيرة والمثبطة لما بعد المشبكي ، استخدم محلولا داخليا قائما على السيزيوم يحتوي على (بالملليمتر): 100 Cs-methanesulfonate ، 8 كلوريد الصوديوم ، 4 ATP-Mg ، 0.5 Li-GTP ، 5 EGTA ، 10 HEPES و 0.2٪ biocytin (وزن / حجم). اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.3 باستخدام CsOH.

2. التحضير ليوم التسجيل

1. لتحضير غشاء النيتروسليلوز بفتحات مفتوحة ، قم بتثقيب الغشاء يدويا باستخدام مثقاب مخصص مصنوع من إبرة حقنة 16 جم وتسطيح الغشاء بين لوحين زجاجيين نظيفين. للحصول على شبكية العين كاملة التثبيت ، قم بعمل ثقب مركزي بقطر 0.2 مم وأحيطه ب 4 ثقوب أكبر يبلغ قطرها 1-1.2 مم.
2. لعمل خيوط ردم مخصصة لتحميل المحلول الداخلي في أقطاب كهربائية، قم بإذابة طرف ماصة سعة 10 ميكرولتر في المنتصف وقم بإطالة الجزء المذاب برفق حتى يبرد ويتصلب. قبل الاستخدام مباشرة، استخدم شفرة حلاقة نظيفة لقص الفتيل حتى يصبح أطول قليلا من ماصات التصحيح.
3. اسحب الماصات اللاصقة في مجتذب قابل للبرمجة من أنبوب زجاجي من البورسليكات بخيوط داخلية. قم بتصنيع الماصات الدقيقة في يوم التجربة واستخدمها على الفور.
   ملاحظه: لتسجيل SACs ، نستخدم إعداد مجتذب التالي: الحرارة: 484 ؛ سحب: 0 ؛ السرعة: 25 ؛ وقت التأخير: 1 ؛ الضغط: 400 وقيمة المنحدر 462. يبلغ القطر الخارجي (OD) والقطر الداخلي (ID) لأنابيب البورسليكات 1.65 مم و 1.0 مم على التوالي. مقاومة الماصات هي 10-14 MΩ.
4. قبل ساعة واحدة من حصاد الأنسجة ، قم بإذابة أنبوب من المحلول الداخلي عن طريق رجه على دوامة لمدة >30 دقيقة.

3. تشريح شبكية

العين

1. تخدير بنسبة 4٪ من الأيزوفلوران في الأكسجين حتى يفقد الاستجابة لقرص إصبع القدم. التضحية بالحيوان عن طريق خلع عنق الرحم.
2. اقطع مقل العينين من الأعصاب البصرية على بعد 1-2 مم من رؤوس العصب البصري بمقص قزحية مستقيم مدبب.
3. لف مقل العيون على منشفة ورقية نظيفة لإزالة الدم ثم اغمرها في محلول Ringer الثديي المكربوجن. قم بعمل ثقب في الليفي بإبرة 23 جم وقم بتقسيم مقل العيون عن طريق القطع على طول الأطراف بمقص صغير. قم بإزالة القرنية والعدسة باستخدام ملقط دقيق.
   1. لتركيب الشبكية بالكامل ، قم بتقشير الشبكية بأكملها برفق من الظهارة المصطبغة باستخدام ملقط دقيق وقم بعمل أربع قطع متعامدة بحجم 1.5-2 مم من الحافة باتجاه رأس العصب البصري.
4. اغمر غشاء النيتروسليلوز المثقوب في الطبق واسحب شبكية العين فوقه برفق مع وضع طبقة الخلية العقدية (GCL) لأعلى. ضع رأس العصب البصري في الفتحة المركزية عند تحضير شبكية العين بالكامل. انقل الغشاء مع شبكية العين إلى طبق نظيف آخر. قم بتسطيح شبكية العين برفق بفرشاة طلاء دقيقة لتبدو وكأنها صليب مالطي وضع الحواف الأربعة فوق الثقوب.
   1. إذا كان سيتم فحص جزء من شبكية العين في وقت واحد ، فقم بقص كل قطعة عين محضرة من الخطوة 3.3 إلى 3-4 قطع بشفرة حلاقة مع بقاء الظهارة المصطبغة متصلة. قم بحماية القطع غير المستخدمة من الضوء في محلول خارجي مكربن واستخدمها في غضون 12 ساعة.
5. امسح غشاء النيتروسليلوز بقطعة من ورق الترشيح الجاف وقم بإزالة الغشاء الزجاجي والداخلي المحدد بالملقط وفرشاة الطلاء.
6. تأكد من أن جميع حواف الشبكية متصلة بالكامل بالغشاء قبل نقل المجموعة إلى غرفة التسجيل مع انزلاق غطاء زجاجي محكم الغلق في الأسفل. قم بتأمين الغشاء بشحم مفرغ في زلة الغطاء وأعد ترطيب شبكية العين بالمحلول الخارجي. احرص على عدم حبس أي فقاعات هواء أسفل التجميع.
7. ضع الغرفة على مسرح المجهر المستقيم. قم بتفريخ الغرفة بمحلول خارجي مكربوني دافئ (34-35 درجة مئوية) بمعدل ~ 3 مل في الدقيقة.
8. افحص شبكية العين تحت عدسة موضوعية 10x أولا ، ثم استخدم عدسة غمر الماء بمعدل 60x لرؤية الخلايا العصبية GCL والطبقة النووية الداخلية (INL) تحت تباين التداخل التفاضلي (DIC) و / أو التألق. لتصور tdTomato-trans SACs ، استخدم مصدر ضوء الصمام الثنائي الباعث للضوء الأبيض (LED) مع مرشح إثارة 554 نانومتر ومرشح انبعاث 581 نانومتر.

< p class = "jove_title" >4. تسجيل مشبك التصحيح للخلية الكاملة من شبكية العين المسطحة

1. قم بتصفية المحلول الداخلي من خلال مرشح حقنة في خيوط الردم المخصصة.
2. أدخل الفتيل في ماصة دقيقة مسحوبة حديثا وقم بتوزيع المحلول الداخلي بالقرب من الطرف حتى يغطي المحلول سلك القطب الفضي بمقدار >5 مم. اربط الماصة الدقيقة على حامل قطب كهربائي بعمود شفط ، يمكن من خلاله ضبط الضغط داخل القطب عن طريق دفع أو سحب مكبس حقنة بلاستيكية متصلة بأنبوب سعة 10 مل.
3. ابحث عن الماصة أسفل الهدف وقم بخفضها إلى ~100 ميكرومتر فوق شبكية العين. في وضع المتابعة الحالية (I = 0) ، استخدم إزاحة التيار المستمر لصفر إشارة جهد التيار المستمر الثابتة. قم بقياس مقاومة الماصة تحت وضع المشبك الحالي (I_Clamp) عن طريق حقن تيارات موجة مربعة ذات سعة ثابتة عبر الماصة أثناء وجودها في الحمام وتحييد الفرق عن طريق تدوير مقبض Raccess. استخدم القراءة الموجودة على مقبض Raccess لحساب مقاومة الماصة وفقا لقانون أوم.
4. ارفع القطب ببطء إلى ~ 10 ميكرومتر فوق شبكية العين. قم بالضغط الإيجابي على القطب. شاهد تغير الانعكاس بالقرب من طرف الماصة عندما يقترب من شبكية العين. قم بإجبار الماصة بسرعة ولكن برفق على الدخول إلى GCL وتقليل الضغط الإيجابي على الفور.
5. حرك الماصة نحو خلية عصبية مصنفة. تجنب الاتصال بالخلايا العصبية الأخرى, الأوعية الدموية ونهاية الأقدام من خلايا مولر. استخدم ضغطا أكثر إيجابية إذا لزم الأمر لمنع انسداد القطب.
6. ضع طرف الماصة بالقرب من خط الوسط للخلايا العصبية المسماة حتى تظهر الغمازة. حرر الضغط الإيجابي واترك غشاء البلازما يرتد مرة أخرى إلى طرف الماصة.
7. ضع تيارات سالبة من 20 إلى 120 باسكال على الماصة للمساعدة في تكوين ختم جيجا أوم. استخدم شفطا لطيفا إذا لزم الأمر لسحب غشاء البلازما إلى الماصة. انتظر 5 دقائق بعد تكوين الختم لتمزق غشاء الخلية. هذا يسمح بإزالة المحلول الداخلي المنسكب عن طريق التروخ. تمزق الغشاء عن طريق شفط لطيف.
8. بعد تمزق الغشاء وأثناء وجوده في وضع المشبك الحالي ، قم بتشغيل توازن الجسر واضبطه باستخدام مقبض Raccess.
   ملاحظه: بالنسبة لخلية صغيرة مثل SAC ، لا يلزم سوى تعديل طفيف ، إن وجد. بدلا من ذلك ، قم بتسجيل التيارات المثيرة والمثبطة لما بعد المشبكي في وضع مشبك الجهد (V_Clamp) عن طريق تثبيت الخلية عند إمكانات انعكاس الكلوريد (حوالي -75 مللي فولت) والغلوتامات (حوالي 0 مللي فولت) ، على التوالي. افحص موضع الماصة واضبطه إذا لزم الأمر لاستيعاب انحراف الشبكية و/أو المناور الدقيق العرضي.
9. لتسجيل إمكانات الغشاء أو التغير الحالي قبل وأثناء وبعد العلاج الدوائي ، قم بإعداد حاصرات متشابكة (على سبيل المثال ، السيانكويكسالين [CNQX] ، (2R) -أمينو-5-فوسفونوبينتانوات [AP5] ، البيكروتوكسين ، توبوكورارين ، إلخ) ومعدلات القنوات (على سبيل المثال ، فلوبيرتين ، دوبامين ، حمض الميكلوفيناميك ، إلخ) طازجة في يوم التجربة من المخزونات المجمدة. تمييع الأدوية بمحلول رينجر المكربن. ضعها على دفعات من خلال التروية.
10. بعد التسجيل ، قم بإزالة الماصة برفق من سوما. انقل التجميع من الغرفة إلى طبق نظيف. افصل شبكية العين وأعد ربطها بغشاء نيتروسلولوز آخر مسطح بدون ثقوب مثقوبة لضمان تسطيح شبكية العين أثناء التثبيت.

المواد