تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.
فئة < ص = "jove_title" >
1. تركيب شرائح أنسجة الحبل الشوكي على MEAs
- قم بتسخين وسط المغذيات المعقمة في الحاضنة (37 درجة مئوية ، غطاء مفكوك قليلا للأكسجين).
- ضع المصفوفة متعددة الأقطاب الكهربائية أو MEA مع ملاقط معقمة ذات أطراف مغطاة بالمطاط في درجة حرارة الغرفة (RT) في طبق بتري تحت مجهر استريو مع تركيز مصفوفة الأقطاب الكهربائية. ضع قطرة 6 ميكرولتر من بلازما الدجاج في المنتصف على مجموعة الأقطاب الكهربائية النظيفة والخالية من الغبار والمعقمة. باستخدام ملعقة صغيرة ، حرك قسمين من الحبل الشوكي بحذر بحيث يكون الجانبين البطنيين مواجها لبعضهما البعض في قطرة البلازما. لا تلمس الأقطاب الكهربائية باستخدام الملعقة.
- أضف 8 ميكرولتر من الثرومبين حول قطرة بلازما الدجاج. باستخدام طرف ماصة الثرومبين ، اخلطي بعناية ووزعي خليط بلازما الدجاج / الثرومبين حول الشريحتين. مرة أخرى ، لا تلمس مجموعة الأقطاب الكهربائية الهشة مباشرة. قبل التخثر مباشرة ، استنشق بلازما الدجاج الزائدة / الثرومبين.
قم - بتغطية طبق بتري للاحتفاظ بالرطوبة العالية بينما يجلس مجموعة MEA / الثقافة لمدة ساعة تقريبا في غرفة رطبة داخل الحاضنة عند 37 درجة مئوية.
- أضف 10 ميكرولتر من وسط المغذيات بحذر إلى غرفة الاستزراع ، وقم بتغطية طبق بتري ، ثم ضعه مرة أخرى في الحاضنة لمدة 30 دقيقة تقريبا.
- ضع كل مجموعة MEA / Culture بأطراف معقمة مغطاة بالمطاط في أنبوب أسطواني ، وأضف 3 مل من وسط المغذيات ، وأغلق الغطاء بإحكام. ضع أنبوب الأسطوانة في أسطوانة الأسطوانة ، مع الدوران بسرعة 1-2 دورة في الدقيقة في الحاضنة في جو يحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 عند 37 درجة مئوية.
- قم بتغيير نصف وسط المغذيات بعد 7 أيام في المختبر (DIV) وبعد ذلك 1-2 مرات في الأسبوع.
< p class = "jove_title" >
2. الآفات الميكانيكية
- خذ مجموعة MEA / الثقافة بأطراف معقمة مغطاة بالمطاط من أنبوب الأسطوانة وضعها في طبق بتري بدون وسط مغذي تحت مجهر استريو مع تركيز الأنسجة في التركيز. تحقق بصريا من اندماج الشريحتين.
- حافظ على ثبات مجموعة MEA / الثقافة عن طريق وضع ملاقط ذات أطراف مغطاة بالمطاط على MEA.
- ضع شفرة مشرط في أخدود MEA بالقرب من شرائح الأنسجة. امسك المشرط أفقيا إلى حد ما.
- ارفع مقبض المشرط لأعلى ولكن اترك شفرة المشرط تبقى في أخدود MEA بطريقة تجعل الشفرة "تتدحرج" من القاعدة إلى الحافة وبالتالي تقطع الأنسجة التي تغطي الأخدود.
- شديد أي وصلات نسيجية متبقية بطرف إبرة 25 جم إذا لزم الأمر. اعمل فقط في المنطقة الموجودة داخل الأخدود ولا تلمس حواف العطاء.
- ضع مجموعة MEA / الثقافة مرة أخرى في أنبوب الأسطوانة. قدم 3 مل من وسط المغذيات الطازجة للمزارع وضعها مرة أخرى في أسطوانة الأسطوانة في الحاضنة.
< p class = "jove_title" >
3. التسجيلات الفيزيولوجية الكهربية للنشاط التلقائي
- للتحقيق في التجديد الوظيفي بين شريحتي الحبل الشوكي بعد العدد المختار من DIV ، قم بتركيب مجموعة MEA / الثقافة في غرفة تسجيل على مجهر وقم بتطبيق حوالي 500 ميكرولتر من محلول خارج الخلية (انظر قائمة المواد).
- انتظر 10 دقائق قبل التسجيل الأول للسماح للنظام بالاستقرار.
- سجل النشاط التلقائي الأساسي 2x لمدة 10 دقائق تقريبا من كل قطب كهربائي للكشف عن النشاط في MEA في RT.
- لضمان ظروف مستقرة خارج الخلية ، قم بتبادل المحلول خارج الخلية بعد كل جلسة تسجيل.
- لإلغاء تثبيط الشبكة ، قم بتطبيق محلول خارج الخلية يحتوي على الإستركنين (1 ميكرومتر) والجابازين (10 ميكرومتر). انتظر لمدة دقيقتين على الأقل قبل بدء التسجيل.
4. تحليل البيانات
ملاحظة: للكشف عن إمكانات الفعل المسجلة خارج الخلية ، استخدم كاشفا يعتمد على الانحرافات المعيارية ومميزا لاحقا لكل قطب.
- اعرض النشاط العصبي المكتشف لكل قطب كهربائي في مخطط نقطي وفقا للإجراءات القياسية (الشكل 1F).
- تحديد وعرض إجمالي نشاط الشبكة لكل شريحة من خلال تلخيص عدد الأحداث في القنوات المناسبة ضمن نافذة منزلقة مدتها 10 مللي ثانية، مع إزاحتها بمقدار 1 مللي ثانية (الشكل 1G).
- اكتشف في كل شريحة رشقات نارية فردية (مجموعات من النشاط تظهر على عدة أقطاب كهربائية). لذلك، قم بتعيين حد أدنى لنشاط الذروة في إجمالي نشاط الشبكة المقابل وحدد كل بداية اندفاع ونهاية اندفاع. على سبيل المثال ، العتبة المناسبة هي 25٪ من متوسط سعة الاندفاع ، ويمكن تعريف بداية الاندفاع على أنها الحدث الأول في نافذة زمنية لا تقل عن 5 مللي ثانية ، ونهاية الاندفاع من خلال كونها الحدث الأخير في نافذة زمنية لا تقل عن 25 مللي ثانية.
- لتحديد التجديد الوظيفي ، احسب النسبة المئوية للرشقات المتزامنة بين الشريحتين. للقيام بذلك ، احسب زمن الانتقال بين الاندفاع في شريحة واحدة والانفجار التالي في الشريحة الأخرى.
ملاحظه: يطلق على زوج الاندفاع اسم "متزامن" عندما يكون زمن الانتقال أصغر من متوسط طول الاندفاع. خاصة في الثقافات المشتركة التي تحتوي على الكثير من النشاط ، هناك احتمال أن يبدأ كلا الجانبين بالصدفة انفجارا في نافذة زمن الوصول المختارة. يجب أن تؤخذ هذه الحقيقة في الاعتبار عند القياس الكمي للنسبة المئوية لرشقات نارية متزامنة.
