الإثارة الخارجية للثقافات العصبية المزخرفة أحادية البعد

الملخص

المصدر: Stern، S.، et al. الإثارة الخارجية للخلايا العصبية باستخدام المجالات الكهربائية والمغناطيسية في ثقافات أحادية الأبعاد وثنائية الأبعاد. J. Vis. Exp. (2017)

يوضح هذا الفيديو تقنية لتحفيز الثقافات العصبية ذات النمط الخطي بمجال كهربائي موحد أحادي الاتجاه.

البروتوكول

ص الفئة = "jove_title" >1. تصوير النشاط التلقائي أو المستحث في الثقافات العصبية بأصباغ الفلورسنت.

1. قم بإعداد محلول من 50 ميكروغرام من صبغة الفلورسنت الحساسة للكالسيوم (انظر جدول المواد / الكواشف) في 50 ميكرولتر DMSO (ثنائي ميثيل سلفوكسيد).
2. تحضير محلول التسجيل خارج الخلية (EM) يحتوي على (بالملليمتر) 10 HEPES ، 4 KCl ، 2 CaCl₂ ، 1 MgCl₂ ، 139 كلوريد الصوديوم ، 10 D-glucose ، 45 سكروز (درجة الحموضة 7.4).
3. احتضان الثقافة العصبية في 2 مل EM مع 8 ميكرولتر من محلول صبغة الفلورسنت الحساس للكالسيوم لمدة 1 ساعة. احميها من الضوء وقم بتدويرها برفق لضمان انتشار متجانس للصبغة إلى الخلايا.
4. استبدل المحلول ب EM جديد قبل التصوير. يظهر التصوير الفلوري في الشكل 1.
5. صورة في مجهر مضان مع مرشحات بصرية للتصوير الفلوري للكالسيوم (ذروة الإثارة عند 488 نانومتر ، ذروة الانبعاث عند 520 نانومتر) ، باستخدام كاميرا وبرنامج قادر على تحديد شدة أي منطقة ذات أهمية (ROI) في مجال رؤية المجهر.

< p class = "jove_title" >2. التحفيز الكهربائي للثقافات

ملاحظة: يظهر الإعداد الأساسي للتحفيز الكهربائي في الشكل 2. يتم وضع زلة الغطاء التي نمت عليها الثقافة العصبية لمدة 14 يوما تقريبا في طبق بتري تحت المجهر الفلوري. يتم تصوير النشاط الكهربائي للخلايا العصبية باستخدام أصباغ حساسة للكالسيوم بينما يتم تطبيق الجهد عبر زوجين من أقطاب الاستحمام الموضوعة خارج المزرعة. يتم تشغيل الأقطاب الكهربائية بواسطة مولد إشارة يتم تضخيم ناتجه بواسطة مضخم ثنائي القناة. يفضل التحكم في الجهد للتحفيز على التحكم في التيار القياسي ، لأن متجهات المجال الكهربائي يتم تحديدها مباشرة ، مما يتيح إضافة المتجه والجمع المباشر. يتطلب ذلك فحصا دقيقا لتوحيد المجال الكهربائي ، والذي يمكن إجراؤه على العينة بأكملها في حالة التحكم في الجهد. عند استخدام التحكم في الجهد ، يجب توخي الحذر لتجنب أي حلقات أرضية ويجب التحقق من تجانس المجال الكهربائي.

1. للتحفيز الكهربائي بمجال كهربائي متجانس ، استخدم زوجا من أسلاك القطب المتوازي.
   1. استخدم أقطاب كهربائية مصنوعة من البلاتين بسماكة 0.005 بوصة (127 ميكرومتر). عند استخدامها مع أغطية 13 مم ، تأكد من أن المسافة بين القطبين حوالي 11 مم ، وضع الأقطاب الكهربائية 1 مم فوق المزرعة.
      ملاحظة: لعمل حامل القطب الكهربائي (الأشكال 3 أ) ، استخدم بولي تترافلورو إيثيلين (PTFE). قم بحفر ثقوب ضيقة من خلال PTFE لإدخال الأقطاب الكهربائية. يجب أن يكون الجهاز أعلى من المحلول خارج الخلية بحيث لا يتلامس الطرف العلوي ، حيث تتعرض الأقطاب الكهربائية ، مع المحلول. للعزل ، استخدم غراء الإيبوكسي على أي جزء من أسلاك القطب الكهربائي التي قد تتعرض لها.
   2. استخدم شكل نبضة مربعة مع دورة عمل بنسبة 50٪ ، بدون مكون تيار مستمر لتجنب التحليل الكهربائي. قم بتغيير مدة النبضة بين 10 ميكرو ثانية و 4 مللي ثانية لإحداث تحفيز فعال دون حرق المزرعة. تأكد من أن السعة في حدود ± 22 فولت (انظر الشكل 3). يمكن ملاحظة النبضة المربعة على راسم الذبذبات المتصل بالتوازي مع الأقطاب الكهربائية.
      ملاحظه: لسهولة البرمجة لأي شكل موجي مرغوب فيه ، استخدم برنامج تحرير شكل الموجة التجاري (انظر قائمة المواد). أدخل الشكل الموجي المطلوب بيانيا وأرسله إلى مولد شكل الموجة.
2. لاختبار تجانس المجال ، استخدم قطب مسبار. استخدم شبكة لا تقل عن 1 مم × 1 مم للسماح بتحريك المسبار في المنطقة بين الأقطاب الكهربائية وقياس الجهد الكهربائي.
   1. قياس الجهد الكهربائي. استخدم لحساب المجال الكهربائي. استخدم أحد الأقطاب الكهربائية كقطب كهربائي مرجعي. قم بقياس المجال الكهربائي بمدد نبضة متفاوتة بين 100 ميكرو ثانية إلى 4 مللي ثانية (انظر الشكل 3 ب للحصول على مثال على مدة النبضة 100 ميكرو ثانية) للتحقق من أن المجال متجانس ضمن نطاق فترات التحفيز.
      ملاحظه: انظر الشكل 3D للحصول على مثال على تجانس المجال الكهربائي المقاس عندما كانت مدة النبضة 1 مللي ثانية.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: أمثلة على آثار عابرات الكالسيوم التي تم تصويرها أثناء رشقات نارية الشبكة المتزامنة. أ. صورة للخلايا العصبية التي تم صبغها قبل التجربة بصبغة الكالسيوم. ب. آثار الشدة مقابل وقت عائد الاستثمار في A مع لون التتبع الذي يمثل لون حدود عائد الاستثمار في A. تمثل الزيادة الكبيرة في الكثافة المتزامنة داخل عائد الاستثمار الثلاثة انفجارا في الشبكة [أدخل الشكل 2]

< p cla...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات كلوريد الكالسيوم ، 1 م فلوكا هاتف: 21098 حل التسجيل خارج الخلية. D- (+) - الجلوكوز ، 1 م سيجما ألدريتش 65146 وسط الطلاء ، حل التسجيل خارج الخلية. هيبس ، 1 م سيجما ألدريتش H0887 حل التسجيل خارج الخلية. KCl ، 3 م ميرك 1049361000 حل التسجيل خارج الخلية. كلوريد المغنيسيوم ، 1 م سيجما ألدريتش م 1028 حل التسجيل خارج الخلية. كلوريد الصوديوم ، 4 م المختبر الحيوي 19030591 حل التسجيل خارج الخلية . السكروز ، 1 م سيجما ألدريتش S1888 حل التسجيل خارج الخلية. أسلاك الأقطاب الكهربائية أنظمة AM ، كارلسبورج واشنطن 767000 التحفيز الكهربائي للثقافات العصبية. مولد الإشارة BKPrecision 4079 تشكيل الإشارة الكهربائية. مكبر محلي الصنع تضخيم الجهد للإشارة من مولد الإشارة إلى الأقطاب الكهربائية. مزود الطاقة مصفوفة MPS-3005 LK-3 امدادات الطاقة لآلة الاخرق. أسلاك بلاتينية بسمك 0.005 بوصة ؛ أنظمة AM ، كارلسبورج واشنطن 767000 التحفيز الكهربائي للثقافات العصبية.