تحفيز الثقافات العصبية المنقوشة بواسطة مجال مغناطيسي

الملخص

المصدر: Stern، S.، et al. ، إثارة خارجية للخلايا العصبية باستخدام المجالات الكهربائية والمغناطيسية في ثقافات أحادية الأبعاد وثنائية الأبعاد. J. Vis. Exp. (2017)

يوضح هذا الفيديو طريقة لتحفيز الثقافات العصبية المزروعة في حلقة دائرية منقوشة على غطاء ، باستخدام مجال مغناطيسي متغير بمرور الوقت.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. إعداد أغطية للثقافات 1D.

1. نظف الأغطية الزجاجية عن طريق الغمر في محلول سمكة بيرانا أساسي يتكون من 75 مل DDW ، و 25 مل 25٪ محلول أمونيا ، و 25 مل 30٪ بيروكسيد الهيدروجين. ضع المحلول مع الغطاء الزجاجي على لوح تسخين عند ~ 50 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، ثم جفف الغطاء الزجاجي بالنيتروجين.
2. أولا ، يتم طلاء الغطاء بغشاء رقيق من الكروم (99.999٪) بسماكة 6 Å ، متبوعا بطبقة 30 Å من الذهب (99.999٪) ، باستخدام ترسب البخار أو الرش.
   1. لتحقيق معدل اخرق من 0.05 - 1 Å / s ، استخدم آلة الاخرق مع 2 شعاع إلكتروني ونظام فراغ 260 لتر / ثانية بأحجام مستهدفة 2 "و 4". استخدم مرحلة الدوران التي يمكن أن تنتقل من 0 إلى 100 جولة في الدقيقة (RPM). استخدم طاقة رش التيار المباشر (DC) من 0 إلى 750 واط.
   2. للحصول على البلازما عند ضغط 10 mTorr في الغرفة ، قم بتدوير الجهاز عند 30 دورة في الدقيقة واستخدم الأرجون عند 99.999٪.
   3. قم بتشغيل مصدر الطاقة لمسدسات الاخرق بقوة رش 40 واط تيار مستمر للكروم ، مما يؤدي إلى معدل تغطية ~ 0.12 Å / s ، وعند 10 واط من طاقة الرش للذهب ، مما يؤدي إلى ~ 0.28 Å / ثانية.
3. باستخدام الموجات فوق الصوتية لمدة 30 دقيقة ، قم بإذابة 0.1 جم 1-أوكتاديكانثيول في 100 مل ABS AR الإيثانول. ضع أغطية مطلية ب Cr-Au في هذا المحلول لمدة 2 ساعة ، ثم اغسلها بالإيثانول ABS AR وجففها بالنيتروجين.
4. قم بإعداد محلول من 100 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (D-PBS) و 3.5 جم من بوليمر مشترك ثلاثي الكتل (انظر جدول المواد / الكواشف) عن طريق التقليب لمدة 1-2 ساعة عند 600-700 دورة في الدقيقة. ضع أغطية في المحلول لمدة 1 ساعة. أغطية جافة بالنيتروجين.
5. حفر النمط المطلوب ميكانيكيا عن طريق خدش طبقة الرفض الحيوي. افعل ذلك باستخدام راسمة القلم ، حيث يتم استبدال القلم بإبرة نقش. خدش النمط من خلال الطبقات المعدنية للوصول إلى الزجاج الأساسي. تحكم في هذه العملية بواسطة جهاز كمبيوتر لتحقيق النمط المطلوب المكرر. يتم توضيح الأنماط التي تشكلت بواسطة هذه العملية في الشكل 1 والشكل 2.
6. قم بإعداد طبقة متوافقة حيويا من 100 مل D-PBS ، و 3.5 جم من البوليمر المشترك ثلاثي الكتل ، و 35.7 ميكرولتر / مل من الفيبرونكتين ، و 29 ميكرولتر / مل من اللامينين.
   1. عقم أغطية الغطاء في ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 10 دقائق على الأقل. احتضان الغطاء في المحلول المتوافق حيويا المحضر طوال الليل.
      ملاحظة: ستتشكل الطبقة المتوافقة حيويا فقط في المكان الذي تم فيه حفر طبقة الرفض الحيوي في الخطوة السابقة.
   2. في اليوم التالي ، اغسل الغطاء مرتين باستخدام P-DBS. احتضنهم في PM بين عشية وضحاها. أغطية جاهزة الآن لطلاء الخلايا.

< ص class = "jove_title" >2. صيانة الثقافات العصبية.

1. تحضير وسط التغيير (سم) يتكون من (لكل مل): 0.9 مل MEM + 3G ، 0.1 مل HI HS ، 10 ميكرولتر 5-fluoro-2′-deoxyuridine (FUDR) مع اليوريدين 100x.
2. تحضير الوسط النهائي (FM) المكون من (لكل مل): 0.9 مل MEM + 3G و 0.1 مل HI HS.
3. استبدل PM ب 1-1.5 مل سم بعد 4 أيام في المختبر (DIV). عند 6 DIV ، استبدل 50٪ من CM بسم جديد. في DIV 8 ، قم بتغيير الوسيط إلى 1.5 مل FM ، متبوعا بتغيير FM بنسبة 50٪ كل يومين. بعد حوالي أسبوع يظهر نشاط متزامن تلقائي.

< ص الفئة = "jove_title" >3. تصوير النشاط التلقائي أو المستحث في الثقافات العصبية بأصباغ الفلورسنت.

1. قم بإعداد محلول من 50 ميكروغرام من صبغة الفلورسنت الحساسة للكالسيوم (انظر جدول المواد / الكواشف) في 50 ميكرولتر DMSO (ثنائي ميثيل سلفوكسيد).
2. تحضير محلول التسجيل خارج الخلية (EM) يحتوي على (بالملليمتر) 10 HEPES ، 4 KCl ، 2 CaCl₂ ، 1 MgCl₂ ، 139 كلوريد الصوديوم ، 10 D-glucose ، 45 سكروز (درجة الحموضة 7.4).
3. احتضان الثقافة العصبية في 2 مل EM مع 8 ميكرولتر من محلول صبغة الفلورسنت الحساس للكالسيوم لمدة 1 ساعة. احميها من الضوء وتدويرها برفق لضمان انتشار الصبغة بشكل متجانس إلى الخلايا.
4. استبدل المحلول ب EM جديد قبل التصوير. يظهر التصوير الفلوري في الشكل 3.
5. صورة في مجهر مضان مع مرشحات بصرية للتصوير الفلوري للكالسيوم (ذروة الإثارة عند 488 نانومتر ، ذروة الانبعاث عند 520 نانومتر) ، باستخدام كاميرا وبرنامج قادر على تحديد شدة أي منطقة ذات أهمية (ROI) في مجال رؤية المجهر.

< p class = "jove_title" >4. التحفيز المغناطيسي للثقافات

ملاحظة: يظهر الإعداد الأساسي للتحفيز المغناطيسي في الشكل 1. في الجزء العلوي الأيمن يظهر مجهر مضان مقلوب يستخدم لتصوير الأصباغ الحساسة للكالسيوم في الخلايا العصبية. يتم وضع الملف المغناطيسي (الدوائر الزرقاء) على بعد حوالي 5 مم بشكل مركزي فوق ثقافة الحلقة العصبية ، (المخطط الأزرق). يراقب ملف الالتقاط (الدائرة الحمراء) على محيط طبق بتري الجهد الناجم عن النبضة المغناطيسية. في الجزء العلوي الأيسر تظهر الديناميكيات المقاسة لملف المحفز المغناطيسي (MS) مع حمل جهد مكثف يبلغ 5,000 كيلو فولت ، كما هو مدمج من ملف الالتقاط. يتم تصوير المجال الكهربائي المستحث (المحسوب لنصف قطر حلقة يبلغ 14 مم) باللون الأخضر بينما يتم تصوير المجال المغناطيسي باللون الأزرق. في الجزء السفلي تظهر صور للثقافة العصبية. في أسفل اليسار توجد صورة ميدانية ساطعة لغطاء منقوش مقاس 24 مم. المناطق البيضاء هي الخلايا العصبية. يتكون النمط المصور من ثقافات حلقية متحدة المركز بنصف قطر مختلف. في أسفل اليمين يوجد تكبير على جزء قصير من الحلقات ، يظهر الخلايا العصبية الفردية. بالنسبة للمقياس ، يبلغ عرض الحلقات حوالي 200 ميكرومتر.

1. قم بزراعة الخلايا العصبية في نمط حلقة دائرية (محفور كما هو موضح في 1.5) لتحفيز الثقافة 1D. استخدم صبغة فلورية حساسة للكالسيوم لتصوير الكالسيوم (كما هو موضح في القسم 3) مع ثقافة 1D منقوشة على خطوط رفيعة (170 ميكرومتر) وطويلة (10 مم).
   1. استخدم ملفا مغناطيسيا دائريا وضع طبق بتري على بعد حوالي 5 مم ومتحدة المركز مع الملف. استخدم ملفا مخصصا يبلغ طوله حوالي 30 مم (القطر الداخلي ، القطر الخارجي 46 مم) مع محاثة L = 90 مللي أمبير مدفوعة ب MS محلي الصنع أو تجاري محمل بجهد أقصى يبلغ 5 كيلو فولت.
   2. لتحفيز الثقافات العصبية مغناطيسيا ، يتم تفريغ الجهد العالي والتيار من خلال ملف موصل باستخدام مفتاح عالي التيار والجهد العالي. يمكن بناء المحفز المغناطيسي (MS) باستخدام مكثفات كبيرة ، في حدود 100 مللي فهرنهايت ، للحصول على جهد عال من 1 إلى 5 كيلو فولت. بدلا من ذلك ، استخدم MS متاحا تجاريا (انظر جدول المواد / الكواشف).
      ملاحظه: استخدم سلكا نحاسيا مستطيلا بسمك 0.254 مم وعرض 6.35 مم مطلي بالبوليستر لتصنيع ملف محلي الصنع. قم بتشغيل الأسلاك على إطارات مخصصة ، معزولة بألياف زجاجية ، وصب في الإيبوكسي (انظر جدول المواد / الكواشف). بدلا من ذلك ، استخدم الملفات المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد / الكواشف).

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: تخطيطي للإعداد المستخدم للتحفيز المغناطيسي للثقافات العصبية. أ. في الجزء العلوي يظهر الملف المغناطيسي (الدوائر الزرقاء) ، والذي يقع على ارتفاع 5 مم بشكل مركزي فوق ثقافة الحلقة العصبية ، ويوضع في طبق بتري (مخطط أزرق). يقيس ملف الالتقاط (الدائرة الحمراء) الموضوعة على محيط طبق بتري الجهد الناجم عن النبضة المغناطيسية. في الجزء السفلي ، يتم عرض الديناميكيات المقاسة لملف المحفز المغناطي...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات كلوريد_{الهواء 2} ، 1 م فلوكا هاتف: 21098 حل التسجيل خارج الخلية D- (+) - الجلوكوز ، 1 م سيجما ألدريتش 65146 وسط الطلاء ، حل التسجيل خارج الخلية د-بي بي إس سيجما ألدريتش د8537 مزارع الخلايا فيبرونيكتين سيجما ألدريتش F1141 طلاء حيوي فلو 4 ، صباحا تقنيات الحياة F14201 تصوير النشاط التلقائي أو المستحث FUDR سيجما ألدريتش F0503 تغيير الوسط جنتاميسين سيجما ألدريتش جي 1272 وسط الطلاء ، تغيير الوسط ، الوسط النهائي. هيبس ، 1 م سيجما ألدريتش H0887 حل التسجيل خارج الخلية مرحبا HS ثنائيه 04-124-1 أ وسط الطلاء ، تغيير الوسط ، الوسط النهائي KCl ، 3 م ميرك 1049361000 حل التسجيل خارج الخلية لامينين سيجما ألدريتش L2020 طلاء حيوي. MEM × 1 جيبكو 21090-022 وسط الطلاء ، تغيير الوسط ، الوسط النهائي كلوريد المغنيسيوم ، 1 م سيجما ألدريتش م 1028 حل التسجيل خارج الخلية كلوريد الصوديوم ، 4 م المختبر الحيوي 19030591 حل التسجيل خارج الخلية أوكتاديكانيثيول سيجما ألدريتش 1858 تنظيف أغطية المغلفة Cr-Au (ثقافات 1D) السكروز ، 1 م سيجما ألدريتش S1888 حل التسجيل خارج الخلية أردين سيجما ألدريتش طراز U3750 تغيير الوسط آلة الاخرق شركة AJA الدولية سلسلة ATC Orion-5 طلاء الزجاج بطبقات رقيقة من المعدن راسمة القلم هيوليت باكارد إتش بي 7475 أ نقش النمط على الغطاء المطلي مزود الطاقة مصفوفة MPS-3005 LK-3 مصدر الطاقة لآلة الاخرق الايبوكسي كوجنيس فيرسميد 140 صب لفائف محلية الصنع الايبوكسي صدفة إيبون 815 صب لفائف محلية الصنع