$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >
1. استئصال مجموعة سكانية فرعية من الخلايا العصبية باستخدام مجهر ليزر ثنائي الفوتون
ملاحظة: إذا كان المستخدمون يخططون لإجراء تصوير الكالسيوم بعد الاستئصال، فاستخدم سطر UAShspzGCaMP6s. إذا كان المستخدمون يخططون لإجراء التسجيل السلوكي بعد الاستئصال ، فاستخدم خط UAS: EGFP ، حيث أن استئصال الخلايا الموجبة ل EGFP أسهل في الأداء من الخلايا التي تعبر عن GCaMP6s.
- ابدأ بإعداد التزاوج لخط Gal4 الذي يصنف الخلايا العصبية المحددة المراد دراستها و UAS: EGFP أو UAShspzGCaMP6s. تأكد من استخدام الخلفية الصدفية لكلا الوالدين بحيث يمكن الحصول على متماثل الزيجوت الصدفي.
ملاحظه: لا تحتوي زيجوت متماثل الصدف على ميلانوفورات على سطح الجسم (الشكل 1 ب). في هذه الدراسة ، يتم استخدام خط Gal4 gSAIzGFFM119B (الذي يصنف pretectum) وخط Gal4 آخر hspGFFDMC76A (الذي يصنف ILH).
- في اليوم التالي من إعداد التزاوج ، اجمع بيض الزرد ، وارفعه إلى مرحلة اليرقات ، وعند هذه النقطة ستعبر الخلايا العصبية ذات الأهمية عن مراسلي الفلورسنت.
- قم بتركيب يرقة الزرد في 2٪ نقطة انصهار منخفضة (الشكل 1 ب).
- ابدأ بتحضير محلول مخزون الاغاروز بنسبة 2٪: قم بإذابة 2 جم من مسحوق الاغاروز منخفض نقطة الانصهار في 100 مل من ماء النظام (أي الماء المستخدم للحفاظ على أسماك الزرد البالغة في نظام المياه المتداولة) أو ماء E3 عن طريق تسخين الماء إلى نقطة الغليان في الميكروويف والخلط بقوة.
- ضعي مرق الاغاروز منخفض نقطة الانصهار بنسبة 2٪ في الميكروويف حتى يغلي. صب 3.5-4.0 مل من الاغاروز على غطاء طبق بتري مقاس 6 سم. انتظر حتى يبرد الاغاروز حتى يصبح دافئا عند لمسه قبل المتابعة.
- بعد ذلك ، ضع يرقة واحدة (غير مخدرة في هذه الخطوة) في الاغاروز. استمر في ضبط موضع اليرقة واتجاهها بحيث تكون منتصبة ، باستخدام إبرة تشريح (الشكل 1C) ، حتى يتجمد الاغاروز لضمان الوضع الصحيح لليرقة.
ملاحظه: ستستمر اليرقة في السباحة بينما تصلب الاغاروز.
- بمجرد وضع اليرقة ، اترك 5 دقائق حتى يتجمد الاغاروز تماما.
- صب 5 مل من محلول التريكيين (0.4٪ بتركيز عمل 1x) فوق الاغاروز.
ملاحظه: لتجنب حركات اليرقات أثناء الاستئصال بالليزر ، يجب أن تظل اليرقات مخدرة طوال عملية الاستئصال.
- استئصال اليرقة باستخدام وظيفة التبييض في نظام مجهر ليزر ثنائي الفوتون.
- ضع اليرقة المضمنة في الاغاروز تحت مجهر المسح الضوئي بالليزر ثنائي الفوتون وابدأ نظام الفحص المجهري.
- ابدأ برنامج الحصول على الصور وانقر فوق الزر "تشغيل" في علامة التبويب "الليزر" لتشغيل الليزر (الشكل 1 د). انتظر حتى تتغير "حالة" الليزر من "مشغول" إلى "مغلق في الوضع".
- في علامة التبويب "القنوات" ، اضبط الطول الموجي لليزر على 880 نانومتر (الطاقة القصوى: حوالي 2,300 ميجاواط) لاستئصال EGFP ، أو عند 800 نانومتر (الطاقة القصوى: حوالي 2,600 ميجاواط) لاستئصال GCaMP.
- حدد العدسة الموضوعية 20X عن طريق تحريك مسدس العدسة يدويا. انقر فوق علامة التبويب "تحديد الموقع" ، وانقر فوق "GFP" لتغيير المسارات البصرية ، وعرض التألق مباشرة بالعين.
- حدد موقع دماغ يرقات الزرد في مركز الرؤية ؛ ثم انقر فوق علامة التبويب "اكتساب" للعودة إلى الفحص المجهري ثنائي الفوتون.
- كسجل لحالة "قبل الاستئصال" ، التقط صورة z-stack باستخدام العدسة الموضوعية 20X بسرعة مسح ضوئي سريعة (لتجنب التلف الحراري). قارن لاحقا الصور الملتقطة قبل تجارب الاستئصال وبعدها (الشكل 2 أ). للحصول على z-stack ، انقر فوق "Z-Stack" لتحديد خيار z-stack وتوسيع علامة التبويب. اضبط الحد الأدنى (انقر فوق الزر "تعيين أولا") بعد التركيز على الطرف البطني لدماغ اليرقات ، وقم بتعيين الحد الأعلى (انقر فوق الزر "تعيين الأخير") بعد التركيز على الجزء الظهري من السطح الظهري للدماغ. ثم انقر فوق الزر "بدء التجربة" لتشغيل الحصول على صور z-stack.
- حدد العدسة الموضوعية 63X عن طريق تحريك مسدس العدسة يدويا.
- انقر فوق علامة التبويب "تحديد الموقع" للتبديل إلى الفحص المجهري الفلوري ، وحدد موقع الخلايا المراد استئصالها في مركز الرؤية بالعين ، ثم انقر فوق علامة التبويب "اكتساب" للعودة إلى الفحص المجهري بالليزر.
- في علامة التبويب "وضع الاستحواذ" ، قم بتعيين "حجم الإطار" على 256 × 256. انقر فوق "مباشر" وراقب الخلايا العصبية ذات الأهمية.
- بدءا من الجانب الظهري ، ابحث عن مستوى بؤري تكون فيه الخلايا المراد استئصالها في بؤرة التركيز.
- ضع علامة على مساحة دائرية صغيرة يبلغ قطرها حوالي ثلث حجم الخلية العصبية على كل خلية عصبية كمنطقة اهتمام (ROI) باستخدام وظيفة "المناطق".
- اضبط سرعة المسح الضوئي على 13.93 ثانية/256 × 256 بكسل (134.42 ميكرومتر × 134.42 ميكرومتر)، وهو ما يتوافق مع وقت مكوث الليزر البالغ حوالي 200 ميكرو ثانية/بكسل، أو 200 ميكرو ثانية/0.5 ميكرومتر. أيضا ، قم بتعيين 4 تكرارات ("دورة التكرار: 4"). بدلا من ذلك ، قم بتحسين عدد التكرارات وسرعة المسح الضوئي بحيث يتم تحقيق الاستئصال الكافي.
- قم بتنفيذ وظيفة "التبييض" للاستئصال ، بالاشتراك مع "السلسلة الزمنية (دورتان)" لتصوير العينة (قبل وبعد الاستئصال) و "المناطق" (لتعيين عائد الاستثمار) أو الوظائف المكافئة في البرنامج المستخدم (الشكل 1 د).
- من خلال مقارنة الصورة الأولى (قبل الاستئصال) والصورة الثانية (بعد الاستئصال) في دورة السلسلة الزمنية ، تأكد من أنه بعد التبييض ، ينخفض التألق في الخلايا المستهدفة إلى ذلك الذي لوحظ على مستوى الخلفية (الشكل 2 ب).
- إذا كان التألق لا يزال موجودا بعد الاستئصال ، فقم بزيادة عدد التكرارات.
- بعد ذلك ، حرك المستوى البؤري أعمق قليلا (أي باتجاه الجانب البطني) ، واختر المستوى البؤري التالي حيث تظهر الخلايا غير المفصلة.
- قم بأداء وظيفة التبييض كما هو موضح أعلاه (الخطوة 1.9). كرر هذه الخطوات حتى يتم استئصال جميع الخلايا في البنية العصبية ذات الاهتمام.
- بعد المرور عبر جميع المستويات البؤرية التي تغطي الهياكل العصبية المراد استئصالها ، تحقق من الخلايا بحثا عن التألق الملغى. إذا تبين أن بعض الخلايا لا تزال فلورية بسبب عدم كفاية الاستئصال ، فقم بإشعاعها بالليزر مرة أخرى كما هو موضح أعلاه.
- إذا احتاجت اليرقة إلى التعافي من الاغاروز بعد تشعيع الليزر ، فلا تحاول إخراجها من الاغاروز لأن ذلك قد يتلف اليرقة. بدلا من ذلك ، قم بعمل قطع صغيرة بعناية في الاغاروز حول اليرقة بشكل عمودي على سطح جسمها. ثم انتظر حتى تسبح اليرقة من الاغاروز من تلقاء نفسها عندما يتلاشى المخدر.
- انتقل إلى اليرقة التالية للاستئصال أو قم بإجراء تجارب التحكم باستخدام مجموعة أخرى من الخلايا العصبية غير المشاركة في السلوك قيد التحقيق.
ملاحظه: هنا ، كعنصر تحكم ، الخلايا العصبية للبصلة الشمية في UAS: EGFP ؛ تم استئصال يرقات gSAIzGFFM119B بالليزر باستخدام نفس البروتوكول الموضح أعلاه (الشكل 2 أ ، على اليمين).
- انتظر عدة ساعات أو يوم واحد للتعافي قبل الشروع في تصوير الكالسيوم (القسم 2) أو التسجيل السلوكي (القسم 3). خلال فترة التعافي هذه ، تحقق من صحة اليرقات (أي السباحة العفوية الطبيعية ، وعدم وجود تلف حراري واضح حول المنطقة المفصولة ، وما إلى ذلك) وإزالة اليرقات التي تظهر عليها أي علامات على اعتلال الصحة.
< p class = "jove_title" >
2. تصوير الكالسيوم لتسجيل النشاط العصبي الذي تثيره الفريسة في يرقات الزرد المفصولة Pretectum
- لتحضير غرفة التسجيل ، ضع حشية غرفة تهجين آمنة الختم على شريحة زجاجية ، بحيث يكون الجانب اللاصق مواجها للزجاج ، وقم بإزالة الختم العلوي.
ملاحظه: يؤدي ذلك إلى إنشاء غرفة تسجيل صغيرة يبلغ قطرها 9 مم وعمقها 0.8 مم (الشكل 3 أ).
- بعد ذلك ، ضع شبكة نايلون (حجم الفتحة: 32 ميكرومتر) على أنبوب سعة 50 مل مفتوح الجزء السفلي. استخدم الغطاء لتوصيل الشبكة على الأنبوب (الشكل 3 ب).
- تحضير الباراميسيا (وهي الفريسة التي سيتم استخدامها كمحفز بصري لليرقة).
ملاحظه: تحضير استزراع البارامسيوم (الخطوتين 2.3.1 و 2.3.2) مسبقا.
- الحصول على استزراع بذور الباراميسيا مسبقا من المصادر التجارية أو مراكز الموارد الحيوية الأكاديمية.
- استزراع البارامسيوم لعدة أيام في ماء يحتوي على قش أرز معقم وحبيبات من خميرة البيرة الجافة (الشكل 3 ج).
- صب مزرعة البارامسيوم من خلال غربالين على التوالي (أحدهما بفتحة 150 ميكرومتر ، متبوعا بالآخر بفتحة 75 ميكرومتر) لإزالة الحطام من المزرعة.
- اجمع paramecia في التدفق من الخطوة السابقة على شبكة من النايلون (فتحة 13 ميكرومتر).
- أعد تعليق الباراميسيا على شبكة النايلون في دورق زجاجي باستخدام زجاجة ضغط من ماء النظام (الشكل 3 د).
- اشطف الشبكة (الشكل 3 ب) في ماء النظام 2x (الشكل 3E).
ملاحظه: الغرض من هذه الخطوة هو إزالة أي روائح وطعم محتمل موجود في وسط زراعة البارامسيوم ، حيث أن الهدف من الدراسة الحالية هو مراقبة النشاط العصبي المدفوع بصريا.
- ضع يرقة سمك الزرد في محلول التريكيين للتخدير.
- قم بتركيب يرقة واحدة في 2٪ من الاغاروز ذات نقطة انصهار منخفضة.
- أولا ، قم بتسخين 2٪ من الاغاروز ذات نقطة الانصهار المنخفضة في الميكروويف وأضف 1/10 حجم من 10x tricaine المركز إلى agarose.
- ضع قطرة واحدة من الاغاروز المحتوي على التريكيين على غرفة التسجيل (الشكل 3 أ).
- بعد التأكد من أن الاغاروز ليس حارا جدا ، ضع اليرقة المخدرة (من الخطوة 2.5) في الاغاروز ، وقم بإزالة أي أغاروز زائد على الفور بحيث يبدو سطح الاغاروز محدبا قليلا.
- قم بتوجيه اليرقة بسرعة إلى وضع مستقيم بإبرة تشريح (الشكل 1C).
ملاحظه: يجب إكمال هذه الإجراءات في غضون عدة ثوان قبل أن تصلب الاغاروز.
- بمجرد وضع اليرقة بشكل صحيح ، اترك 5 دقائق حتى يتجمد الاغاروز تماما. ثم صب قطرة من محلول التريكيين 1x على الاغاروز.
- قم بإزالة الاغاروز حول رأس يرقة الزرد وإفساح المجال للبارامسيوم للسباحة باستخدام سكين جراحي. للقيام بذلك ، أولا ، قم بعمل بعض التخفيضات الصغيرة في الاغاروز (الشكل 3F). بعد ذلك ، قم بإزالة الاغاروز الزائد بعناية عن طريق سكب ماء النظام برفق على الغرفة.
ملاحظه: في هذه الخطوة ، سيتم غسل التريكيين.
- بعد ذلك ، ضع بارامسيوم واحد في غرفة التسجيل ليكون بمثابة حافز بصري.
ملاحظه: عندما يسبح البارامسيوم بالقرب من رأس يرقة الزرد ، فإنه سيثير استجابة عصبية (الشكل 3G).
- ضع غرفة التسجيل تحت مجهر epi-fluorescence المزود بكاميرا CMOS علمية (الشكل 3H) وحدد عدسة موضوعية 2.5X (الشكل 3I).
- اجمع تسجيلات اللقطات المتتابعة لإشارات التألق GCaMP.
- ابدأ تطبيق الحصول على الصور للكاميرا المجهزة.
- انقر فوق "جزء التسلسل" وحدد "سجل القرص الصلب" في الجزء. في قسم إعدادات المسح الضوئي، اضبط "عدد الإطارات" على 900 أو أي رقم إجمالي آخر مطلوب.
ملاحظه: إذا كان ذلك متاحا ، فاستخدم برنامج التسجيل بفاصل زمني مع وحدة نمطية (هنا ، "سجل القرص الصلب") تتيح الحفظ الفعال للبيانات على محرك الأقراص الثابتة.
- في جزء "الالتقاط"، اضبط وقت التعريض الضوئي على 30 مللي ثانية (أي 33.3 إطارا في الثانية)، وBinning 2 × 2.
- على لوحة اللمس التي تتحكم في المجهر ، اختر مجموعة مرشح ل GFP ، حيث أن GCaMP له أطياف إثارة / انبعاث مماثلة ل GFP.
- انقر فوق "مباشر" في جزء الالتقاط لتحديد موقع اليرقة في عرض الكاميرا والتركيز عليها (الشكل 4 أ) ، ثم انقر فوق "إيقاف البث المباشر" وانقر فوق الزر "ابدأ". احفظ الفيلم بتنسيق .cxd أو أي تنسيق آخر يحتوي على معلومات حول حالة الاكتساب.
