دراسة استثارة الخلايا العصبية الفلورية باستخدام مشبك التصحيح للخلية الكاملة

الملخص

المصدر: Briz ، CG ، وآخرون ، في مناهج التثقيب الكهربائي للرحم لدراسة استثارة المجموعات السكانية الفرعية العصبية والاتصال أحادي الخلية. J. Vis. Exp. (2017)

يوضح الفيديو طريقة لدراسة استثارة الخلايا العصبية التي تعبر عن البروتين الفلوري باستخدام مشبك تيار رقعة للخلية بأكملها. في وضع المشبك الحالي ، يتم إنشاء إمكانات الفعل التي تدل على استثارة الخلايا العصبية.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.

< p class = "jove_title" >1. الفيزيولوجيا الكهربية

ملاحظة: الهدف من هذا البروتوكول هو الحصول على تسجيلات مشبك تيار الخلية بأكملها من الخلايا العصبية الهرمية من الطبقة الثانية / الثالثة التي تم تحديدها بصريا بواسطة تعبير GFP في أدمغة الفئران المكهربة ب GFP (أو أي بروتين فلوري آخر تم فتحه بالكهرباء مسبقا). باستخدام هذا البروتوكول ، من الممكن دراسة تأثير التعديل الجيني الذي أدخله IUE على الخصائص الكهربائية للخلايا العصبية. يعد اكتساب أنماط إطلاق محددة عملية تمايز تدريجية تنطوي على التعبير الديناميكي عن ذخيرة واسعة من القنوات الأيونية والتي تؤدي إلى التعبير عن أوضاع إطلاق عابرة قبل مراحل ما بعد الولادة المتأخرة. على سبيل المثال ، لا يتم ملاحظة الاستجابات الكهربائية الناضجة في الطبقات II / III من قشرة الفأر الحسية الجسدية قبل P16.

1. المتطلبات الأساسية للشرائح الحادة
   1. تحضير 1 لتر من ACSF باستخدام عالي النقاء (ماء مقطر مزدوج) يحتوي على 119 ملي كلوريد الصوديوم ، و 26 ملي مولار من NaHCO₃ ، و 11 ملي جلوكوز ، و 2.5 ملي كلوريد كلوريد ، و 1.2 ملي كلوريد_{المجم 2} ، و 2.5 ملي كلوريد الكالسيوم₂ ، و 1 ملي هيدروهيدروجين₂PO₄. قم بمعايرة الرقم الهيدروجيني إلى 7.3 - 7.4 باستخدام حمض الهيدروكلوريك أو هيدروكسيد الصوديوم. اضبط الأسمولية على 290 مللي أسم.
   2. فقاعة ACSF مع الكربوجين (95٪ O₂/5٪ CO₂) لمدة 15 - 20 دقيقة باستخدام أنابيب التفلون (~ 1 مم) ، لتثبيت الرقم الهيدروجيني إلى 7.3 - 7.4.
2. المتطلبات الأساسية لتسجيل الخلية بأكملها
   1. تأكد من أن محطة الفيزيولوجيا الكهربية مجهزة بغرفة تسجيل ، ونظام نتروية ، ومجهر ، وأقطاب كهربائية (تسجيل ، وتحفيز ، وأرض) ، ومعالجات كبيرة ودقيقة ، وسطح طاولة صلب مقاوم للاهتزاز وقفص فاراداي ، ومحفز ، ومضخم ومحول تناظري إلى رقمي (A / D) ، وجهاز كمبيوتر مزود ببرنامج اقتناء ، ومرشح GFP (أو أي فلوروكروم آخر) لتحليل الخلايا العصبية المعدلة وراثيا (الشكل 1 أ).
   2. تحضير المحلول داخل الخلايا ، الذي يحتوي على 115 ملي مولار من غلوكونات البوتاسيوم ، و 2 ملي ملي كلوريد_{البوتاسيوم 2} ، و 10 ملي هيبس ، و 20 ملي مولار من كلوريد البوتاسيوم ، و 4 ملي مولار Na₂ATP ، و 0.3 ملي Na₃GTP ، معدلة إلى درجة الحموضة 7.2 بواسطة KOH و 290 mOsm بواسطة KCl.
   3. اصنع ماصات رقعة عن طريق سحب الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات. قم بإعداد أقطاب التصحيح باستخدام مجتذب الماصات الدقيقة. استخدم الشعيرات الدموية البورسليكات (القطر الخارجي 1.5 مم ، القطر الداخلي 0.86 مم ، الطول 10 سم). اصنع أقطاب كهربائية تظهر مقاومة من 3 إلى 10 MΩ عند ملؤها بمحلول داخل الخلايا.
   قم
   4. بدمج غرفة التسجيل باستخدام ACSF بمعدل 2 مل / دقيقة.
3. تسجيل خلية كاملة
   1. انقل الشرائح إلى غرفة التسجيل باستخدام ماصة باستور (قطع الطرف الطويل) أو فرشاة صغيرة. امسك الشريحة باستمرار بالقيثارة. قم بتنقية الشرائح باستمرار باستخدام ACSF بمعدل 2 مل / دقيقة.
   2. تصحيح خلية عصبية إيجابية GFP.
      1. ضع الشريحة في غرفة التسجيل وابحث عن منطقة الاهتمام من خلال المجهر بتكبير منخفض (10X). بعد ذلك ، ابحث عن خلية إيجابية GFP لتصحيحها باستخدام هدف 60x.
      2. املأ قطب التسجيل بمحلول داخل الخلايا. استخدم المحقنة المرتبطة بالفلتر (مرشح 4 مم) وطرف اللودر الدقيق لملء قطب التسجيل بمحلول داخل الخلايا.
      3. ضع الماصة الزجاجية في حامل الماصة. ضع طرف الماصة في الحمام وركز على الحافة. بمجرد أن تكون الماصة في الحمام، قم بالضغط الإيجابي من خلال نظام التحكم في الضغط الخلفي.
      4. قم بتصحيح خلية عصبية فلورية (الشكل 1 ب).
         1. اقترب من الخلية ذات الأهمية تحت التوجيه البصري مع الحفاظ على الضغط الخلفي في الماصة. عند ظهور غمازة صغيرة على سطح الخلية ، حرر الضغط. في هذه المرحلة ، قد يتم تشكيل ختم محكم (مقاومة أكبر من 1 GΩ). خلاف ذلك ، قم بتطبيق ضغط سلبي خفيف (شفط) لتسهيل ذلك.
         2. أثناء تشكيل الختم ، قم بإحضار مشبك جهد التثبيت إلى -60 مللي فولت. بمجرد تشكيل ختم GΩ ، قم بتطبيق نبضة شفط لتمزيق غشاء الخلية أسفل الماصة والانتقال إلى وضع الخلية بأكملها.
      5. سجل النشاط باستخدام ظروف المشبك الحالي. بمجرد الدخول في وضع الخلية الكاملة ، قم بالتبديل من مشبك الجهد إلى وضع المشبك الحالي وابدأ التسجيل. على سبيل المثال ، لتسجيل استثارة الخلية ، قم بتطبيق حقن تيار إزالة الاستقطاب بطول 500 مللي ثانية (100 - 400 باسكال).
         1. احسب معدلات إطلاق النار عن طريق رسم عدد إمكانات الفعل على طول القطار لزيادة تيارات الإدخال.
            ملاحظه: يمكن أيضا حساب إمكانات الغشاء المريح ومقاومة المدخلات وسعة الغشاء من التسجيلات.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1. إعدادات الفيزيولوجيا الكهربية ومثال على استجابة إطلاق النار. أ. تظهر الصورة إعداد الفيزيولوجيا الكهربية المستخدم في تجارب مشبك التصحيح في الشرائح الحادة. يتم تضمين الإعداد في قفص فاراداي للتخلص من الضوضاء ، والجهاز أعلى طاولة مضادة للاهتزاز. لوحظت وحدات التحكم في المعالجات الدقيقة الآلية للأقطاب الكهربائية على اليسار. ب. الخلايا ا...

المواد